Anatomopathologie des tumeurs et pseudo-tumeurs primitives pleurales

Anatomopathologie des tumeurs et pseudo-tumeurs primitives pleurales

ÎMémoire © Masson, Paris 2006 - Rev Pneumol Clin 2006 ; 62 : 80-86 Anatomopathologie des tumeurs et pseudo-tumeurs primitives pleurales D. Salameire1...

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ÎMémoire © Masson, Paris 2006 - Rev Pneumol Clin 2006 ; 62 : 80-86

Anatomopathologie des tumeurs et pseudo-tumeurs primitives pleurales D. Salameire1, M.-H. Laverrière1, G. Ferretti2, P.-Y. Brichon3, S. Lantuéjoul1 80 1

Département de Pathologie, 2 Département de Radiologie, Département de Chirurgie Thoracique et Cardiovasculaire, CHU A.-Michallon, BP 217, 38043 Grenoble Cedex. 3

Correspondance : S. Lantuéjoul, à l’adresse ci-dessus. [email protected]

Résumé

Summary

Les tumeurs primitives pleurales sont des tumeurs relativement rares, comportant les mésothéliomes épithélioïdes, biphasiques ou sarcomatoïdes, les lymphomes primitifs pleuraux et des tumeurs mésenchymateuses dont la tumeur solitaire fibreuse, l’hémangioendothéliome épithélioïde et l’angiosarcome, et le synovialosarcome. Nous détaillerons ainsi, en se basant sur la nouvelle classification de l’OMS 2004, ces différentes entités sans aborder les tumeurs métastatiques de la plèvre qui restent, cependant, les tumeurs les plus fréquemment rencontrées dans cette localisation.

Pathology of primary tumors and pseudotumors of the pleura

Mots-clés : Classification OMS. Plèvre. Mésothéliome. Hémangioendothéliome épithélioïde. Synovialosarcome. Tumeur solitaire fibreuse. Lymphome.

L

es tumeurs pleurales sont relativement rares et sont surtout représentées par les métastases des adénocarcinomes, des carcinomes malpighiens, des carcinomes à petites cellules, en encore des mélanomes. Les tumeurs primitives de la plèvre les plus fréquentes sont les tumeurs solitaires fibreuses, les mésothéliomes et les sarcomes, les tumeurs malignes constituant seulement 2 à 3 % de toutes les tumeurs pleurales. Le diagnostic de ces tumeurs nécessite un matériel histologique suffisant, obtenu par une biopsie à l’aiguille ou préférentiellement par une biopsie chirurgicale (thoracoscopie), et doit permettre de distinguer les processus réactionnels bénins responsables d’un épaississement pleural, des proliférations malignes comme les mésothéliomes.

Primary tumors are relatively rare in the pleura. Histological types include mesothelioma, epitheliod, biphasic or sarcomatoid tumors as well as primary lymphoma and mesenchymatous tumors which include solitary fibrous tumor, epithelioid hemangioendothelioma and angiosarcoma and synovialosarcoma. We detail here the new WHO classification 2004 explaining the different entities, excluding metastatic tumors which are the most frequent tumors of the pleura. Key-words: WHO classification. Pleura. Mesothelioma. Epithelioid hemangioendothelioma. Synovialosarcoma. Solitary fibrous tumor. Lymphoma.

Nous décrirons ici l’ensemble des tumeurs primitives et pseudotumeurs de la plèvre en insistant sur les classes histologiques les plus fréquentes et en nous appuyant sur le document de référence que constitue la classification de l’OMS 2004 des tumeurs pulmonaires et pleurales (tableau I).

Proliférations mésothéliales Ce chapitre détaille les mésothéliomes (malins), leur variants et les proliférations mésothéliales bénignes pseudo-tumorales réactionnelles.

D. Salameire et al.

Tableau I. - Classification OMS des tumeurs primitives pleurales. Tumeurs mésothéliales Mésothéliome malin diffus Mésothéliome épithélioïde Mésothéliome sarcomatoïde Mésothéliome desmoplastique Mésothéliome biphasique Mésothéliome malin localisé Autres tumeurs mésothéliales Mésothéliome papillaire très bien différencié Tumeur adénomatoïde Lymphoproliférations Lymphome d’effusion

localisés et les mésothéliomes bien différenciés. La reconnaissance de ces variants est importante pour le pathologiste dans le diagnostic différentiel avec les carcinomes métastatiques ou les sarcomes pleuraux, mais ne présente pas d’intérêt pronostique particulier, sauf peut-être pour les mésothéliomes localisés et bien différenciés. Les mésothéliomes épithélioïdes, qui constituent environ un tiers des mésothéliomes, sont composés de cellules d’allure épithéliale, rondes ou ovalaires, souvent de grande taille, au cytoplasme éosinophile, et sont dotées d’un noyau peu atypique discrètement nucléolé. Ces cellules forment des nappes, bordent des fentes ou ébauchent des structures pseudo-glandulaires tubulopapillaires (fig. 1). Les mitoses et la nécrose sont rares. Le stroma est variable, parfois fibreux, parfois myxoïde. La prolifération tumorale envahit typiquement tout le tissu pleural et infiltre la graisse sous-pleurale (fig. 2). Ce

Lymphome associé au pyothorax Tumeurs mésenchymateuses Hémangioendothéliome épithélioïde/Angiosarcome Synovialosarcome Synovialosarcome monophasique Synovialosarcome biphasique Tumeur fibreuse solitaire Tumeur calcifiée de la plèvre Tumeur desmoplastique à petites cellules rondes

Mésothéliomes Les mésothéliomes sont par définition des tumeurs malignes développées aux dépens du revêtement mésothélial pleural, et qui se caractérisent par une diffusion à la surface de la plèvre. Macroscopiquement, les mésothéliomes se présentent au stade initial de la maladie sous la forme de multiples nodules de petite taille, implantés à la surface de la plèvre pariétale ou viscérale, et qui vont confluer avec le temps pour former une couenne tumorale épaisse, fibreuse ou à surface gélatineuse, qui enserrera et comprimera le poumon. L’extension tumorale se fait macroscopiquement aux septa interlobulaires, au diaphragme, à la paroi thoracique, au médiastin et au péricarde ainsi qu’à la cavité pleurale controlatérale. Les mésothéliomes peuvent également métastaser au parenchyme pulmonaire et aux ganglions lymphatiques hilaires et médiastinaux. D’après la nouvelle classification de l’OMS 2004 [1], plusieurs variants histologiques sont décrits dont les mésothéliomes diffus épithélioïdes, biphasiques, sarcomatoïdes et desmoplastiques, les mésothéliomes

Figure 1. - Mésothéliome épithélioïde dont les cellules tumorales forment des fentes ou des pseudo-glandes (coloration à hématoxyline-éosine-safran (HES ; x 200).

Figure 2. - Infiltration caractéristique de la graisse sous-pleurale par un mésothéliome épithélioïde (HES ; x 200).

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dernier élément permet de faire la différence avec une prolifération mésothéliale bénigne réactionnelle. Plus rarement, les cellules tumorales peuvent être de petite taille (mésothéliome à petites cellules), claires ou encore anaplasiques et/ou à cellules géantes. Ces variantes cellulaires sont à connaître pour le diagnostic différentiel avec un carcinome rénal, un carcinome à petites cellules ou une tumeur desmoplastique à petites cellules rondes de la plèvre, ou encore avec un lymphome ou un sarcome. Le principal diagnostic différentiel du mésothéliome épithélioïde reste l’adénocarcinome métastatique et justifie la réalisation d’une étude histochimique et immunohistochimique systématique. La première vise à confirmer l’absence de mucosécrétion par les cellules tumorales (colorations des mucines PASdiastase et Kreyberg négatives). L’étude immunohistochimique permet de mettre en évidence une expression de marqueurs spécifiques des cellules mésothéliales tels que la cytokératine 5/6 et la calrétinine et confirme l’absence d’expression de marqueurs des adénocarcinomes (ACE, CD15, BerEP4, B72.3, MOC31, et TTF1 pour les adénocarcinomes pulmonaires) [2, 3, 4, 5]. Les diagnostics différentiels de tous les sous-types de mésothéliomes sont résumés dans le tableau II. Les mésothéliomes sarcomatoïdes constituent moins de 10 % des mésothéliomes et sont composés de cellules fusiformes, arrangées en faisceaux rappelant un fibrosarcome. Lorsque les cellules sont très atypiques, elles peuvent faire évoquer un sarcome pléiomorphe. Ces mésothéliomes sont souvent faiblement cytokératine et calrétinine positifs (fig. 3) et peuvent exprimer de façon un peu surprenante des marqueurs des fibres musculaires (actine et desmine). Le diagnostic différentiel avec une métastase pleurale d’un carcinome sarcomatoïde pulmonaire (faiblement cytokératine positif, et dans plus de la moitié des cas TTF1 négatif) peut s’avérer également difficile et reposera plus sur des données cliniques et macroscopiques que sur l’étude immunohistochimique. Il faut garder à l’esprit que les localisations pleurales des sarcomes, au premier rang desquels on retrouve le synovialosarcome, sont particulièrement rares.

L’étude immunohistochimique, associée à la mise en évidence de transcrits de fusion, permettra de rétablir le diagnostic. Le mésothéliome desmoplastique est une variante du mésothéliome sarcomatoïde et se caractérise par un stroma collagène dense, constituant plus de la moitié du volume tumoral, au sein duquel s’observent quelques cellules tumorales modérément atypiques (fig. 4). Le principal diagnostic différentiel est la pleurésie fibreuse. L’étude immunohistochimique est peu utile, le critère diagnostique essentiel étant morphologique démontrant l’infiltration par les cellules fusiformes de la graisse sous-pleurale et éventuellement des structures pariétales. D’autres éléments comme la présence de mitoses, des plages de nécrose ou des métastases à distance plaident en faveur de la malignité. Les mésothéliomes biphasiques, qui représentent environ 30 % des cas, associent une composante épithélioïde et une composante sarcomatoïde, chaque composante devant constituer au moins 10 % de la prolifération. Il n’existe pas de critères histopronostiques ou cytogénétiques reconnus pour les mésothéliomes, même si les mésothéliomes épithélioïdes semblent avoir une survie supérieure à celle des mésothéliomes sarcomatoïdes (présentant le plus mauvais pronostic). Néanmoins, les différences en matière de survie entre ces différentes entités restent de l’ordre de quelques mois.

Mésothéliome papillaire bien différencié Il s’agit d’une entité distincte des autres mésothéliomes en raison de son architecture typiquement papillaire, des anomalies cytologiques peu marquées des cellules tumorales et de sa tendance à l’extension à la surface de la plèvre sans envahissement du tissu pleural proprement dit. C’est une tumeur très rare au niveau de la plèvre (moins d’une cinquantaine de cas rapportés dans la littérature) [6, 7] et qui est classiquement décrite au niveau du péritoine chez les femmes. Le mésothéliome papillaire bien différencié survient sans prédominance

Tableau II. - Diagnostics différentiels des mésothéliomes malins diffus. Métastases pleurales : carcinomes, sarcomes, lymphomes, mélanomes Sarcomes primitifs pleuraux : angiosarcomes, hémangiendothéliome épithélioïde, synovialosarcome, autres sarcomes Tumeurs thymiques primitives ou secondaires Tumeur desmoplastique à cellules rondes/sarcomes d’Ewing Tumeurs pleurales localisées : mésothéliome malin localisé, tumeur solitaire fibreuse, sarcomes, mésothéliome papillaire bien différencié, plaque pleurale

D. Salameire et al.

Mésothéliome malin localisé Il s’agit d’une tumeur rare, qui se présente sous la forme d’une lésion nodulaire, strictement localisée, et pédiculée ou sessile. Elle peut atteindre 10 cm de grand axe mais n’envahit pas le reste de la plèvre. Son identification est fondée essentiellement sur des données radiologiques car, histologiquement et sur le plan phénotypique, cette tumeur correspond à un mésothéliome malin typique, de type épithélioïde, sarcomatoïde ou biphasique. Son pronostic semble néanmoins meilleur que celui des autres mésothéliomes puisqu’une résection chirurgicale complète est curative la plupart du temps. Ces tumeurs peuvent, cependant, récidiver et métastaser, comme le ferait un sarcome [8]. Figure 3. - Cas identique au précédent: expression par les cellules tumorales de la cytokératine 5/6 sous la forme d’un marquage spécifique cytoplasmique (immunoperoxydase ; x 200).

Figure 4. - Mésothéliome sarcomatoïde de type desmoplastique (HES ; x 100).

de sexe chez des adultes d’âge moyen (63 ans), et sa relation à une exposition à l’amiante n’est pas établie actuellement. Cette tumeur se caractérise par une évolution indolente et une longue survie. Macroscopiquement, elle peut être diffuse ou localisée, formant des nodules à la surface des plèvres viscérales ou pariétales. Sur le plan histologique, elle forme des papilles à axe conjonctif myxoïde, revêtues de cellules mésothéliales peu atypiques, plutôt cubiques. Si on se réfère à la définition stricte, il n’y a pas d’invasion du tissu pleural sous-jacent par les cellules tumorales, à la différence de ce que l’on observe dans les contingents bien différenciés papillaires de certains mésothéliomes malins invasifs.

Hyperplasie mésothéliale pseudo-tumorale Dans certains cas, le diagnostic différentiel entre prolifération mésothéliale bénigne réactionnelle plus ou moins atypique et prolifération maligne reste difficile sur des prélèvements biopsiques de petite taille et si l’on considère uniquement les aspects cytologiques des cellules mésothéliales. En effet, certaines hyperplasies mésothéliales sont constituées de cellules atypiques, siège de mitoses, et qui ont tendance de façon naturelle à s’égoutter au sein du tissu conjonctif pleural. A l’opposé, certains mésothéliomes peuvent apparaître relativement innocents, peu atypiques et peu proliférants. Le critère le plus fiable dans ce cas de figure reste l’envahissement diffus et homogène du tissu conjonctif, et surtout de la graisse sous-pleurale dans le cas d’un mésothéliome. A l’inverse, une prolifération mésothéliale réactionnelle s’accompagne souvent d’un infiltrat inflammatoire, d’une néoangiogenèse et d’un gradient de cellules mésothéliales dont la densité s’épuise en profondeur et respecte les adipocytes. L’ensemble de ces critères n’est, bien sûr, appréciable que sur un prélèvement histologique de taille raisonnable et orientable, c’est-à-dire dont la surface et la profondeur sont identifiables avec certitude.

Lymphomes pleuraux Les lymphomes pleuraux primitifs sont le lymphome pleural avec effusion et le lymphome associé à un pyothorax.

Lymphome pleural avec effusion Il s’agit d’un lymphome à grandes cellules de type B envahissant de façon diffuse la plèvre, plus rarement le péricarde ou le péritoine, sans former de masse tumo-

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rale, et en l’absence d’adénopathie ou d’organomégalie. Cette tumeur survient le plus souvent chez les immunodéprimés et notamment les patients HIV+ [9], en relation avec une infestation par HHV8 (human herpes virus 8)/ KSHV (Kaposi sarcoma herpes virus). De rares cas sont associés à une maladie de Castleman. Ce type de lymphome est de très mauvais pronostic, la survie des patients ne dépassant habituellement pas un an. Sur le plan histologique, on observe une colonisation de la surface de la plèvre, plus rarement une infiltration du tissu pleural, par une nappe de cellules malignes de grande taille, d’aspect immunoblastique, plasmoblastique ou anaplasique. Ces cellules comportent un cytoplasme basophile abondant, un noyau de grande taille, rond ou ovalaire, centré d’un nucléole proéminent. Certaines cellules peuvent être pluri-nucléées, de type ReedSternberg. En immunohistochimie, les cellules tumorales expriment l’antigène pan-leucocytaire CD45 mais sont généralement négatives vis à vis des marqueurs des cellules lymphoïdes B (CD19, CD20, CD79a). En revanche, elles expriment dans la grande majorité des cas le CD30 et les marqueurs de la lignée plasmocytaire (CD38 et CD138). Enfin la mise en évidence d’une expression de la protéine latente HHV8/KSHV en immunohistochimie peut s’avérer une aide précieuse au diagnostic.

passé de pyothorax dû à un pneumothorax pour traitement d’une tuberculose ou séquellaire d’une pleurésie tuberculeuse survenue 20 à 40 ans auparavant. Ces patients ont en moyenne 65 à 70 ans et sont le plus souvent des hommes.

Tumeurs mésenchymateuses Hémangioendothéliome épithélioïde/ angiosarcome

Il s’agit d’un lymphome de type B associé au virus Epstein-Barr (EBV) (70 à 100 % des cas) (fig. 5) et se présentant sous la forme d’une masse tumorale pleurale avec envahissement direct des structures attenantes (paroi thoracique, poumon, diaphragme) [10]. Ce type de lymphome survient chez des patients ayant un long

L’hémangioendothéliome épithélioïde (HEE) est une tumeur vasculaire de grade intermédiaire formant des travées ou des îlots de cellules endothéliales d’aspect épithélioïde. L’âge moyen de survenue est de 52 ans, et environ 70 % des patients sont des hommes. Ils présentent généralement un épaississement pleural associé à un épanchement et, parfois, des localisations pulmonaires. Les HEE de la plèvre sont des tumeurs plus agressives que leurs homologues pulmonaires, hépatiques ou osseux, et aucun traitement n’a démontré son efficacité jusqu’à maintenant. Macroscopiquement, l’HEE envahit diffusément la plèvre et ressemble ainsi à un mésothéliome. Sur le plan histologique, l’HEE est volontiers biphasique, associant des foyers de cellules épithélioïdes à une composante fusiforme, sur un fond myxoïde ou chondroïde. Les cellules forment des travées ou des nids, plus rarement des structures papillaires. Elles renferment de façon caractéristique une ou plusieurs hématies au sein de leur cytoplasme. L’HEE ressemble à l’angiosarcome épithélioïde, ce dernier se différenciant cependant par la présence de cellules plus atypiques, de plages de nécrose et par un index mitotique élevé (fig. 6).

Figure 5. - Lymphome malin associé au pyothorax (HES ; x 200).

Figure 6. - Angiosarcome primitif de la plèvre (HES ; x 200).

Lymphome associé à un pyothorax

D. Salameire et al.

Sur le plan immunohistochimique, les cellules tumorales expriment le CD31, le CD34, Fli1 et le facteur VIII. De façon trompeuse, elles sont, dans 50 % des cas, cytokératine positives et sont souvent prises à tord pour des cellules adénocarcinomateuses [11].

Synovialosarcome Les synovialosarcomes (SS) sont des tumeurs soit biphasiques, associant une composante épithéliale à une composante fusiforme, soit monophasiques fusiformes. Ce sont des tumeurs de l’adulte jeune (moyenne d’âge 25 ans). Elles se traduisent par des douleurs pleurales, des effusions ou un pneumothorax. Potentiellement agressives, elles sont responsables dans 50 % des cas d’un décès, dans un délai moyen de 18 mois. Elles présentent une forte tendance à la récidive et envahissent volontiers la paroi thoracique, le péricarde ou le diaphragme. Macroscopiquement, les SS forment des masses localisées, solides, de grande taille (moyenne de 13 cm), parfois encapsulées ou pédiculées. Certaines sont responsables d’un épaississement pleural diffus et miment ainsi un mésothéliome. Histologiquement, la prolifération tumorale est monomorphe, faite de cellules fusiformes agencées en trousseaux plus ou moins enchevêtrés (fig. 7). Leurs noyaux sont allongés, hyperchromatiques, peu atypiques ; la composante épithéliale, lorsqu’elle est présente, élabore des glandes ou des fentes bordées de cellules cubiques. Sur le plan immunohistochimique, les cellules tumorales expriment le Bcl2, et de façon plus inconstante les cytokératines et l’EMA. La mise en évidence du transcrit de

Figure 7. - Synovialosarcome (HES ; x 200).

monophasique

primitif

pleural

fusion issue de la translocation spécifique t(X;18) permet d’asseoir le diagnostic [12].

Tumeur solitaire fibreuse Appelée autrefois « fibrome pleural » ou même « mésothéliome fibreux bénin », la tumeur solitaire fibreuse (TSF) est développée, semble-t-il, aux dépens des cellules fibroblatiques du tissu conjonctif pleural. Elle se présente sous la forme d’une masse souvent pédiculée, bien délimitée, appendue à la plèvre viscérale, plus rarement intrapulmonaire ou médiastinale. Elle peut engendrer une toux, des douleurs thoraciques ou une dyspnée, parfois même une ostéoarthropathie hypertrophiante pneumique ou une hypoglycémie. Macroscopiquement, cette tumeur présente une tranche de section blanchâtre, fasciculée, parfois myxoïde, hémorragique, et même nécrotique. Ces deux derniers critères, ajoutés à une grande taille, doivent faire évoquer la malignité. Histologiquement, elle alterne des plages hypocellulaires et hypercellulaires, parcourues par des vaisseaux ramifiés. Elle se compose de cellules fusiformes agencées en faisceaux entrecroisés (fig. 8). Les TSF malignes, qui restent exceptionnelles, se caractérisent par une cellularité importante, un index mitotique > 4 mitoses/10 champs, et des atypies cellulaires [13]. Sur le plan immunohistochimique, ces tumeurs expriment le CD34 et le Bcl2 et sont toujours négatives pour les cytokératines. Nous ne détaillerons pas la tumeur calcifiée de la plèvre, ni la tumeur desmoplastique à petites cellules rondes, tumeur plus fréquente chez l’adulte jeune masculin et qui se caractérise par la présence de lobules de cellules

Figure 8. - Tumeur solitaire fibreuse (HES ; x 200).

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tumorales de petite taille, au sein d’un stroma desmoplastique typique. Cette tumeur présente de façon caractéristique une translocation t(11;22). Références 1.

2.

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3.

4.

5.

6.

Travis WD, Brambilla E, Muller-Hermelink KH, Haris CC. WHO classification of tumours of the lung, pleura, thymus and heart. Lyon: IARCC Press, 2004. Comin CE, Novelli L, Boddi V, Paglierani M, Dini S. Calretinin, thrombomodulin, CEA, and CD15: a useful combination of immunohistochemical markers for differentiating pleural epithelial mesothelioma from peripheral pulmonary adenocarcinoma. Hum Pathol 2001;32:529-36. Tot T. The value of cytokeratins 20 and 7 in discriminating metastatic adenocarcinomas from pleural mesotheliomas. Cancer 2001;92:2727-32. Ordonez NG. The immunohistochemical diagnosis of mesothelioma: a comparative study of epithelioid mesothelioma and lung adenocarcinoma. Am J Surg Pathol 2003;27: 1031-51. Ordonez NG. Value of cytokeratin 5/6 immunostaining in distinguishing epithelial mesothelioma of the pleura from lung adenocarcinoma. Am J Surg Pathol 1998;22:1215-21. Butnor KJ, Sporn TA, Hammar SP, Rogli VL. Well-differentiated papillary mesothelioma. Am J Surg Pathol 2001;25:1304-9.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

Galateau-Salle F, Vignaud JM, Burke L, Gibbs A, Brambilla E, Attanoos R, et al., and the Mesopath Group. Well-differentiated papillary mesothelioma of the pleura: a series of 24 cases. Am J Surg Pathol 2004;28:534-40. Crotty TB, Myers JL, Katzenstein AL, Tazelaar HD, Swensen SJ, Churg A. Localized malignant mesothelioma. A clinicopathologic and flow cytometric study. Am J Surg Pathol 1994;18:357-63. Nador RG, Cesarman E, Chadburn A, Dawson DB, Ansari MQ, Sald J, et al. Primary effusion lymphoma: a distinct clinicopathologic entity associated with the Kaposi’s sarcoma-associated herpes virus. Blood 1996;88:645-56. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW. WHO classification of tumours. Pathology and genetics of tumours of hematopoietic and lymphoid tissus. 1st ed. Lyon: IARCC Press, 2001. Lin BT, Colby T, Gown AM, Hammar SP, Mertens RB, Churg A, et al. Malignant vascular tumors of the serous membranes mimicking mesothelioma. A report of 14 cases. Am J Surg Pathol 1996;20:1431-9. Gaertner E, Zeren EH, Fleming MV, Colby TV, Travis WD. Biphasic synovial sarcomas arising in the pleural cavity. A clinicopathologic study of five cases. Am J Surg Pathol 1996;20:36-45. England DM, Hochholzer L, Mc Carthy MJ. Localized benign and malignant fibrous tumors of the pleura. A clinicopathologic review of 223 cases. Am J Surg Pathol 1989;13:640-58.