Biologie de Pseudomonas aeruginosa

Biologie de Pseudomonas aeruginosa

M 6 d e c i n e e t M a l a d i e s I n f e c t i e u s e s - - 1983 - - 13 - - N ° 6 bi s - - 352 fi 356 Biologie de P s e u d o m o n a s aerugino...

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M 6 d e c i n e e t M a l a d i e s I n f e c t i e u s e s - - 1983 - - 13 - - N ° 6 bi s - - 352 fi 356

Biologie de P s e u d o m o n a s

aeruginosa *

par M. VERON ** RESUME

Modble de bacterie a m6tabolisme respiratoire strict, Pseudomonas aeruginosa peut neanmoins se developper dans des niches 6cologiques trbs variees, y compris les segments anaerobies du tube digestif de I'homme. Cette bacterie produit de nombreux facteurs de virulence, parmi lesquels un lipopoly-saccharide et une exotoxine prot6ique jouent un r61e essentiel, soit comme antig6ne protecteur, soit comme un facteur toxique respectivement. La physiopathologie de l'infection h bacilles pyocyaniques fait apparaitre le r61e essentiel d'une part de la phagocytose initiale, d'autre part d'une tox6mie plus tardive, de pronostic tres grave.

Mots-clef : P s e u d o m o n a s aeruginosa - Bacille pyocyanique - Virulence - Toxine. TABLEAU

Le bacille pyocyanique, ou Pseudomonas aeruginosa, est une bact6rie saprophyte de l'environn e m e n t , trbs r6pandue dans l'eau et le sol humide, qui peut cependant vivre en commensale d a n s le tube digestif de l'homme et des animaux. S o n int6r6t m6dical r6side principalement dans le fait qu'elle est responsable d'infections ,, opp o r t u n i s t e s ,, souvent graves et difficiles fi gu6rir, en raison d'une forte r6sistance fi de nombreux antibiotiques.

I : Modes de production d'Onergie par Pseudomonas aeruginosa

EN A E R O B I O S E

-

M6tabolisme

respiratoire,

Utilisation comme seule source de carbone et d'6nergie de nombreux substrats carbon6s (auxanogramme en milieu min6ral-ammonium) : par exemple 63% des 146 substrats essay6s (Stanier et c o l l . , 1 9 6 6 ) , Acidification oxydative de certains sucres et a l o o o l s (milieu Mevag),

--

RAPPEL TAXONOMIQUE

Hydrolyse de macromol6cules : gOlatine, 16cithine, D N A . EN A N A E ROBIOSE Respiration des nitrates (avec production d'ammoniac e t d ' a z o -

Pseudomonas aeruginosa est l'espece-type du genre Pseudomonas~ genre-type de la famille des Pseudomonadaceae ou Pseudomonades. Les Pseud o m o n a d e s sont des bacilles fi Gram n6gatif, g6n 6 r a l e m e n t mobiles grfice/~ des flagelles polaires, o u parfois immobiles, qui constituent le modble des bact6ries a6robies strictes, c'est-a-dire fi m6t a b o l i s m e strictement respiratoire d6pourvues de m6tabolisme fermentatif des glucides.

te),

Respiration ana6robie de la pyocyanine,

--

Hydrolyse de I'arginine ( A D H ) ,

-

Pas de m6tabolisme fermentatif.

avec p a r exemple production d'acide gluconique /~ p a r t i r du glucose) ; ce m6tabolisme oxydatifest tr6s different de la fermentation. Cette production d'6nergie par oxydation des carbohydrates repr6sente un m~canisme de production d'6nergie primitif au cours de l'6volution, qui a disparu chez un grand nombre d'autres bact6ries, au profit des m6canismes de fermentation. Malgre son m 6 t a b o l i s m e respiratoire strict, le bacille pyoc y a n i q u e peut utiliser d'autres accepteurs finals d'61ectrons en l'absence d'oxyg~ne (tableau I). Cette propri6t6 lui permet de croitre en ana6rob i o s e dans des milieux organiques trbs divers, fi c o n d i t i o n qu'un accepteur convenable d'elect r o n s soit pr6sent, en particulier le nitrate ou la p y o c y a n i n e (pigment ph6nazinique hydrosoluble p r o d u i t de faqon caracteristique par cette bacterie). Enfin, le bacille pyocyanique peut 6galement tirer son 6nergie en ana6robiose en hydrolysant l'arginine grfice fi un systbme enzymatique d6~¢. n o m m 6 l'arginine-dihydrolase constitutive (1).

En a6robiose, le bacille pyocyanique utilise l'oxyg6ne c o m m e accepteur final d'61ectrons (tab l e a u I). I1 est capable d'utiliser de nombreux s u b s t r a t s carbon6s c o m m e seule source de carb o n e et d'6nergie, dans un milieu min6ral simple (1). Grfice/~ diverses enzymes p6riplasmiques, il est 6galement capable d'hydrolyser de nombreuses macromol6cules qui lui fournissent ainsi des s o u r c e s d'6nergie pour sa croissance. Enfin, dans des milieux peu tamponn6s (2, 3), il est capable de p r o d u i r e de faibles quantit6s d'acide par oxydation de n o m b r e u x sucres ald6hydiques (oxydation de la fonction ald6hyde en fonction acide, * C o m m u n i c a t i o n p r 6 s e n t 6 e fi la J o u r n 6 e de la Soci6t6 de P a t h o l o g i e I n f e c t i e u s e de L a n g u e F r a n q a i s e , Creteil, 3.12.1982. ** L a b o r a t o i r e c e n t r a l de B a c t 6 r i o l o g i e - V i r o l o g i e , H 6 p i t a l N e c k e r - E n f a n t s M a l a d e s , 149 rue de Sbvres, 75730 P a r i s c e de x 15.

--

"~

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Cette grande diversit6 de production d'6nergie, doubl6e d'une forte r6sistance ~t de nombreux a g e n t s chimiques, permet de comprendre comm e n t une bact6rie a6robie stricte comme le bacille pyocyanique est capable de se developper d ' u n e part en a6robiose dans des milieux naturels trbs simples et d'autre part en ana6robiose, dans des milieux organiques aussi complexes que l'intestin, en particulier d ans ses segments termin a u x fortement ana6robies. L'utilisation d'un milieu de culture s61ectif pour le bacille pyocyanique (4) a permis en effet de constater la pr6sence du bacille pyocyanique dans les selles de nomb r e u x sujets. I1 est m6me vraisemblable de consid6rer que presque t o u s l e s sujets sains sont port e u r s de cette bact6rie dans l'intestin.

p o r t fi plusieurs chaines laterales 6galement polysaccharidiques. Ces chaines laterales portent la sp6cificit6 de l'antigbne 0 ou antigone s o m a t i q u e ; elles forment un feutrage autour de la bact6rie. Bas6s sur la sp6cificit6 de cet antigene thermostable, 16 groupes antig6niques 0 ont 6t6 d6crits chez P. aeruginosa, peuvent servir de marqueurs 6pid6miologiques. Trois types principaux de colonies bact6riennes sur g61ose peuvent 6tre observ6s avec P. aeruginosa : colonies la (large) ou F.E. (fried egg), de taille moyenne, d'aspect irregulier et rugueux, les plus fr6quentes ; colonies sm (small), petites, r6gulibres et lisses ; colonies M (muqueuses), assez rares (fibrose kystique du pancr6as). Cette variat i o n morphologique semble 6tre li6e & une modif i c a t i o n de structure de la membrane externe, et p a r t i c u l i ~ r e m e n t de l'antigbne 0. Bien qu'6voq u a n t la classique variation : lisse --~ rugueux (S --~ R) observ6e surtout chez les Enterobacteriaceae, le ph6nombne est ici diff6rent : les colonies FE sont plut6t plus virulentes que les colonies sm (6, 7).

ANATOMIE FONCTIONNELLE DE P. AERUGINOSA

P. aeruginosa a la structure g6n6rale des bacilles/t G r a m n6gatif, mais la membrane externe de sa paroi est d6coll6e du peptidoglycane, la liaison e n t r e ces deux feuillets 6tant assur6e par des lipoprot6ines. Autour du noyau et du cytoplasme, on observe, de l'int6rieur vers l'ext6rieur : --la m e m b r a n e cytoplasmique, qui contient e n t r e autres la majorit6 des enzymes de phosphor y l a t i o n et les aldoses deshydrog6nases responsables du m6tabolisme oxydatif des sucres ; - - le peptidoglycane ou mur6ine, feuillet rdsisrant, assurant la forme de la cellule (6quilibre avec la pression osmotique interne), et constit u a n t une sorte de grillage fi mailles grossi~res a u t o u r de la m e m b r a n e cytoplasmique ; - - l'espace p6riplasmique, qui contient des enz y m e s p6riplasmiques capables d'hydrolyser divers compos6s ou macromol6cules ; --et enfin la m e m b r a n e de la paroi et les c o n s t i t u a n t s superficiels, structures particulibrem e n t importantes puisqu'elles sont en contact avec le milieu ext6rieur et sont donc responsables de diverses propri6t6s biologiques de la bact6rie.

La m e m b r a n e externe contient aussi les r6cept e u r s sp6cifiques (possiblement li6s au LPS) de divers bact6riophages et pyocines, qui peuvent 6 g a l e m e n t servir de marqueurs 6pid6miologiques (lysotypie, pyocinotypie).Elle contient d'autre p a r t des prot6ines de transport qui permett e n t la perm6ation de diverses mol6cules, en part i c u l i e r de certains antibiotiques. Ces prot6ines sont responsables de la r6sistance intrins~que ~t de n o m b r e u x antibiotiques; paradoxalement, c'est la modification, d'origine g6n6tique, d'une de ces prot6ines qui explique le ph6nombne de supersensibilit6, par exemple de certaines souches M vis-~t-vis de la carb6nicilline.

POUVOIR

E n v i r o n 20 % du poids de la membrane externe c o r r e s p o n d e n t ~ l'endotoxine ou lipopolysaccharide (LPS), macromol6cule complexe constitu6e de trois parties li6es dans l'ordre suivant (5): lipide A, ,, core ,~ ou polysaccharide de base, et c h a i n e s lat6rales. Le lipide A, qui est la partie responsable de la toxicit6, est inclus dans la memb r a n e externe ; il est probablement li6 a des prot~ines de cette membrane. Le ~, core ,, polysacc h a r i d i q u e est attach6 au lipide A et sert de sup-

PATHOGENE

EXPERIMENTAL

Bas6e sur une information incomplbte, une 16g e n d e tenace veut que, il y a cent ans, les infections ~t P. aeruginosa aient et6 jug6es comme peu graves, la survenue de suppui~ations fi ,, pus bleu ,, 6tant m6me consid6r6e comme le signe d ' u n pronostic favorable. Cette vue optimiste t6m o i g n a i t peut-6tre d'un jugement relatif, a l'epoque ou de nombreuses maladies infectieuses, auj o u r d ' h u i disparues ou devenues rares, avaient r6gulibrement un pronostic redoutable. N6an-

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moins, la gravite des infections a bacilles pyocyan i q u e s a 6t6 reconnue dbs la fin du XIX e sibcle, en p a r t i c u l i e r en France par Charrin (r6f. in 6).

LES FACTEURS DE VIRULENCE

Les facteurs de virulence du bacille pyocyaniq u e ont 6t6 6tudi6s depuis plus de 20 ans, en p a r t i c u l i e r aux U.S.A. par Liu et collaborateurs (ref. in 8). Les principaux facteurs connus sont i n d i q u 6 s dans le tableau II. Ils sont diff6renci6s p r i n c i p a l e m e n t par les effets qu'ils provoquent, in vitro ou in vivo. Mais leur nature chimique d 6 p e n d essentiellement des m6thodes d'extract i o n et de purification utilis6es et il est probable que certains facteurs ne sont que des variantes b i o c h i m i q u e s simplifi6es d'autres facteurs plus complexes.

Actuellement, le bacille pyocyanique est qualifi6 de ,, bact6rie opportuniste ,,, expression r6serv6e aux bact6ries qui ne semblent pouvoir infecter que des patients dont les m6canismes de d6fense sont d6faillants. N6anmoins et peut-6tre en r a i s o n des progr~s de la m6decine qui permettent de prot6ger les patients fi d6fense d6ficiente (compromised host), la fr6quence des infections ~tbacilles pyocyaniques reste 61ev6e, ainsi que leur gravit6. Les problbmes pos6s par ces infections sont expos6s dans les publications suivantes. Nous n ' i n d i q u e r o n s donc ici que les renseignements fournis par l'6tude du pouvoir pathogbne exp6rim e n t a l de cette bact6rie (cf. r6f. in 8).

II : Facteurs de virulence produits par Pseudomonas aeruginosa

TABLEAU

Chez l ' a n i m a l immuno-comp6tent, les souches h a b i t u e l l e s de P. aeruginosa sont consid6r6es c o m m e peu virulentes, ce qui veut dire que leur dose 16tale 50 % (DL 50) est 61ev6e : par vole g6n6rale par exemple, elle a 6t6 estim6e fi 10 TM pour le singe macaque, 10s pour le cobaye et 107 - 10s pour la souris. Quelques diff6rences sont observ6es seIon la voie de p6n6tration : Buck et Cooke ont e s t i m 6 par exemple que l'homme doit ing6rer au m o i n s 106 bact6ries pour que son tube digestif soit colonis6. Il existe cependant des variations de virulence, et on peut s61ectionner des souches trbs virulentes dont la DL~a pour la souris est voisine de 10 par voie p6ritoneale, par exemple aprbs des passages r6p6t6s in vivo. Heureusement, de telles souches trbs virulentes sont rarement rencontr6es dans la nature.

Toxicit6

Agissant Iocalement : H6molysine thermostable Ph ospholipase Prot6ases F a c t e u r d e p e r m 6 a b i t i t ~ vasculaire Ent6rotoxine LPS (endotoxine)

II)

+ ++ ++ + + +

Agissant par voie g6n6rale : Exotoxine Exoenzyme S

++++ ++

La majorit6 des facteurs de virulence connus s o n t li6s fi la cellule bact6rienne et n'agissent d o n c que localement, au niveau du foyer inflamm a t o i r e . C'est le cas, en particulier, ~le l'h6molysine thermostable, glycolipide dont les rapports possibles avec le LPS n'ont pas 6t6 pr6cis6s, et du f a c t e u r de perm6abilit6 vasculaire, prot6ine prod u i t e seulement par quelques souches et provoq u a n t un aedbme et une extravasation sanguine. Seules, 6galement, quelques souches produisent u n e ent6rotoxine, responsable d'ent6rocolites, en p a r t i c u l i e r secondaires ~ un traitement oral inconsid6r6 par des antibiotiques qui, inactifs sur P. aeruginosa, le s61ectionnent dans l'intestin ; c o m m e d'autres ent6rotoxines, cette toxine prod u i t un gonflement de l'anse ligatur6e du lapin.

Chez l'animal immunod6prim6, la DL50 des souches habituelles est alors nettement diminu6e : par exemple, 105 pour le macaque trait6 p a r l'hyp6rite, qui provoque chez lui une agranulocytose, 1/t 10 bact6ries chez la souris trait6e aux r a y o n s X ou au cyclophosphamide. En fait, cet accroissement relatif de virulence c o r r e s p o n d fi une sensibilit6 accrue de l'h6te et n o n fi une modification de la bact6rie. Ce m6can i s m e est particulibrement bien d6montr6 par les exp6riences de Millican et coll. (9) chez la souris brfil6e : dans les conditions de l'exp6rience, le bacille pyocyanique ne se montre tr~s virulent, chez la souris brfil6e, que pendant les 4 ou 5 jours qui suivent le stress de la brOlure ; pass6 ce d61ai, les a n i m a u x ont reconstitu6 leurs moyens de d6fense et r6sistent au challenge qui avait tu6 leurs cong6neres juste apres la brfilure.

Les facteurs de virulence locale les plus import a n t s sont en fait les enzymes p6riplasmiques de l'endotoxine. La phospholipase ou 16cithinase est u n e toxine comparable a la toxine a de Clostrid i u m perfringens ; elle provoque un oed6me local, avec 6rythbme et parfois h6morragie, en particulier dans les infections cutan6es. Le bacille pyoc y a n i q u e produit aussi trois ou quatre proteases (cas6inase, 61astase, parfois collag6nase) respon-

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sables localement d'une hemorragie et d'une necrose. Toutes ces enzymes p6riplasmiques, mod6r e m e n t toxiques, sont antig6niques; les anticorps produits sont sp6cifiques d'espbces: ils n e u t r a l i s e n t Faction de l'enzyme correspond a n t e , quelle que soit la souche de pyocyanique productrice.

MODELE PHYSIOPATHOLOGIQUE

C o n t r a i r e m e n t a une idle fort repandue, la c o n t a m i n a t i o n d'un patient par le bacille pyocyan i q u e peut 6tre d'origine endog6ne (flore fecale). N e a n m o i n s , une source exog6ne est souvent retrouv6e, les principales 6tant les suivantes : l'eau de boisson ou de lavage, les !6gumes crus (salades), les fleurs coup6es ou plantes en pots, les solutions souill~es de soi-disant antiseptiques (6,

Le LPS ou endotoxine est extrait facilement par la m6thode eau-ph6nol de Westphal ou m6me par une simple solution saline (6). Avec d'autres m e t h o d e s d'extraction, en particulier apr~s hydrolyse acide, le LPS est soit m61ang6 avec des prot6ines, soit d6grad6 ; dans ce cas la solution (souvent appel6e ~, slime ~, mucus) contient surt o u t des polysaccharides. Le LPS est peu toxique p a r lui-m6me (DL50 voisine de 1 mg pour la souris) ; cependant, il peut 6tre relargu6 spontanefnent dans les tissus et contribuer ainsi a la form a t i o n de la r6action inflammatoire. Les chaines lat6rales polysaccharidiques de l'antigbne 0, qui c o n s t i t u e n t un feutrage autour de la cellule bact6rienne, pourraient aussi 6tre un moyen de d6fense de la bact6rie contre la phagocytose. En r6alit6, le LPS parait surtout important indirectement par sa fonction antig6nique ; en effet, les anticorps p r o d u i t s sont protecteurs, et cette protection est sp6cifique du groupe de l'antig6ne 0.

8). L'ent~rite a bacilles pyocyaniques a un m6can i s m e physiopathologique proche de celui d'autres ent6rites, qui ne sera pas d6velopp6 ici. Dans le cas g~n6ral, la colonisation se produit habituell e m e n t au niveau des muqueuses (bronches, ceil) ou des plaies (blessures, brfllures). Chez un pat i e n t non immunis6 contre une souche du m6me s~rogroupe O (cf. figure 1), une multiplication r a p i d e des bact6ries se produit qui, sous l'influence des facteurs de virulence d6jfi cit6s, et en p a r t i c u l i e r du LPS, provoque la formation d'un foyer inflammatoire local. Dans ce foyer, se c o n c e n t r e n t de nombreux phagocytes, principal e m e n t des polynucl6aires, qui vont, dans les cas favorables, assurer une destruction rapide des bact6ries. Cependant, des anticorps s6riques, specifiques d'esp~ces pour les enzymes et de groupe p o u r le LPS, sont produits en quelques jours, m a i s trop tard pour jouer un r61e dans les ph6nom~nes imm6diats.

En fait, le facteur principal de virulence est l'exotoxine diffusible, d6couverte en 1966 par Liu (10), dans le sang de lapins moribonds, inocul6s p a r P. aeruginosa. Cette toxine prot6ique est d6t r u i t e habituellement in vitro par les prot6ases, m a i s elle a pt~ 6tre extraite et purifi6e a partir de c u l t u r e s de m u t a n t s non prot6olytiques. Cette holoprot6ine a un pouvoir toxique trbs important chez la souris (DL50 voisine de 0,1/~g). Inject6e p a r voie dermique, elle est dermon6crotique ; par voie p6riton6ale, elle provoque une leucop6nie et une n6crose de divers visc6res (foie, poumons, reins). Mais in vitro, dans un systbme acellulaire, elle n'a pas de propri6t6 remarquable. Iglewski et K a b a t (11) ont d6montr6 que l'exotoxine du bacille pyocyanique avait le m6me m6canisme d'action que la toxine dipht6rique : arr6t de la synth6se prot6ique par inhibition du facteur ribosomal EF 2. L'effet 16tal est lent : 2 fi 3 jours chez la souris, quelques heures en culture cellulaire. Trois types antig6niques, A, B e t C, ont 6t6 observ6s, mais plus de 90 % des souches de P. aerugin o s a produisent l'exotoxine A. Les anticorps antitoxiques, dont l'activit6 neutralisante est tres forte, sont sp6cifiques du type de la toxine. Une a u t r e prot6ine diffusible, d6nomm6e exoenzyme S, a 6t6 d6crite dont les propri6t6s sont encore real connues.

CONTAMI~TI~ endo- ou e x o g ~

bact~rienne & Leucocytes actifs

l~unod~pra~.-~

~Jet . + tralt~ent bact~riostatique

Traltement Inefficace

Trait~ent bact~clde

En cas de d6ficience immunitaire, portant p r i n c i p a l e m e n t sur le nombre et/ou la qualit6 des polynucl6aires, la phagocytose est insuffisante, et un stade d'invasion succede fi celui de colonisation. Les bacteries d6bordent alors les barri6res cellulaires de d6fense dans le foyer inflammatoire et se multiplient ; une bact6ri6mie est habituellem e n t constat~e, avec d'6ventuelles localisations secondaires. La production d'exotoxine est intense et sa diffusion tr~s large (stade de tox6mie). A c e stade, le pronostic de l'infection est critique 355

et l'6volution d6pend strictement de l'effet des a.ntibiotiques sur la multiplication et/ou la survie des bact6ries (cf. figure 1).

alors trbs rapide et une bact6ricidie tr6s efficace se produit, assurant la gu6rison. L'infection a bacilles pyocyaniques apparait donc c o m m e un mod6le particuli6rement net d'immunit6 du type B, off les polynucl6aires et les anticorps humoraux anti LPS jouent un r61e pred o m i n a n t au stade pr6coce de l'infection. Mais, si ce stade est d6pass6, comme cela se produit chez les sujets immuno-d6ficients, en particulier granulop6niques, une infection grave tox6mique se produit contre laquelle le syst6me immunitaire parait peu actif. L'usage th6rapeutique d'antitoxines, theoriquement indiqu6, n'a pas encore, semble-t-il, 6t6 ddvelopp6.

Si l'effet du traitement n'est que bact6riostatique, chez un sujet dont les fonctions phagocytaires sont d6ficientes, un 6quilibre instable entre h6te et bact6ries s'installe, qui peut occasionner des rechutes et un 6tat d'infection chronique. Chez un sujet d6jfi immunis6, soit par une infection pr6alable avec une souche du m~me s6rogroupe 0, soit par une vaccination polyvalente, les anticorps anti LPS ont un r61e tr~s net d'opsonines : la phagocytose qui se produit dans le foyer inflammatoire, au stade de colonisation, devient

SUMMARY

P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a has a metabolism strictly respiratory, never fermentative. However it is able to live in the anaerobic parts o f intestinal tract. It produces many virulence factors, particularly a lipopolysaccharide and a exotoxine acting as protective antigen or toxic factor, respectively. The study o f the physiopathology of infection by P. a e r u g i n o s a shows the essential role o f an early phagocytosis and o f a later toxemia, the pronostic o f which is very serious.

Key words : P s e u d o m o n a s a e n a g i n o s a - Virulence - Toxine - Immunity.

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