Intérêts et limites de la quantification de l’ADN VIH

Intérêts et limites de la quantification de l’ADN VIH

Biologie moléculaire Intérêts et limites de la quantification de l’ADN VIH Comparaison des quantifications de l’ADN proviral lors des infections par ...

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Biologie moléculaire

Intérêts et limites de la quantification de l’ADN VIH Comparaison des quantifications de l’ADN proviral lors des infections par VIH-1 et par VIH-2 M. Gueudin(1), F. Simon(2) (1) Laboratoire de Virologie, UPRES EA2656, CHU Charles Nicolle, 76000 Rouen. (2) Laboratoire de Microbiologie, CHU Saint Louis, 75475 Paris 10. Correspondance : F. SIMON, voir adresse ci-dessus (2). e-mail : franç[email protected]

Résumé/Abstract ■■ ■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■ Intérêts et limites de la quantification de l’ADN VIH. Comparaison des quantifications de l’ADN proviral lors des infections par VIH-1 et par VIH-2 M. Gueudin, F. Simon Objectifs. L’infection par VIH-2 est moins pathogène que celle par VIH-1 et les charges virales plasmatiques VIH-2 sont très inférieures à celles observées lors des infections par VIH-1. Ces différences d’histoire naturelle entre les deux infections en font un modèle d’étude idéal pour évaluer l’intérêt de la quantification des différentes formes de l’ADN VIH. Méthodes. Pour comparer les quantités d’ADN total et d’ADN sous forme circularisée à 2-LTR lors des infections par VIH-1 et par VIH-2, nous avons mis au point des PCR quantitatives en temps réel avec des standards communs aux deux virus. Ces techniques ont été appliquées in vitro à la quantification des ADN VIH-1 ou VIH-2 lors des cycles de réplication en cultures de PBMC humains de différents donneurs et sur différentes lignées cellulaires. Les quantités d’ADN ont été également comparées entre 44 patients infectés par VIH-1 et 41 patients infectés par VIH-2 à des stades identiques d’immunodépression et naïfs de traitement antirétroviral. Résultats. Quelles que soient les PBMC et les lignées cellulaires, la quantité d’ADN total des souches VIH-2 reste inférieure à celle des souches VIH-1 jusqu’à 96 heures ; en revanche VIH2 produit plus de formes à 2-LTR que VIH-1. Chez les patients, la différence entre les charges virales ADN total VIH-1 et VIH-2 est hautement significative pour les patients avec plus de 300 CD4/μl. Nous mettons en évidence des différences de production in vitro entre les ADN totaux des deux types de VIH et confirmons cette différence chez les patients naïfs avec plus de 300 CD4/μl. Inversement, nous mettons en évidence in vitro une accumulation plus importante des formes d’ADN circularisés à 2-LTR lors des infections par VIH-2. Conclusion. Notre travail confirme l’intérêt de ces marqueurs ADN totaux et circularisés et montre que la quantification de l’ADN est parallèle à l’histoire naturelle des VIH, l’accumulation des formes à 2-LTR pouvant correspondre à une moindre capacité d’intégration du VIH-2. Mots-clés : Infection VIH-2, VIH-1, charge virale plasmatique, PCR quantitative, quantification ADN VIH-1/VIH-2.

Advantages and limits in quantification of HIV-DNA. Comparison of quantifications of proviral DNA in HIV-1 and HIV-2 M. Gueudin, F. Simon Objectives. The lesser pathogenicity of HIV-2 relative to HIV-1 is generally attributed to its slower replication. The objectives were to compare the amounts of total DNA and 2-LTR circular DNA during HIV-1 and HIV-2 infection. Methods. We developed quantitative real-time PCR methods based on two plasmid calibrators bearing sequences corresponding to both HIV-1 and HIV-2. Quantifications of total and circular HIV-1 and HIV-2 DNA were applied in vitro to replication cycles in cultures of PBMC

Introduction L’objectif de l’étude est de dégager l’intérêt de la quantification de l’ADN lors des infections par VIH-1 et VIH-2. Le traitement de l’infection par le VIH1 repose désormais sur de puissantes associations de molécules inhibitrices de 199 Liste des abréviations VIH-1

Virus de l’Immundéficience de type 1 VIH-2 Virus de l’Immunodéficience de type 2 CD4 Lymphocyte T4 helper PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells LTR Long Terminal Repeat HIV-1 NL4-3 Souche prototype VIH-1, fortement réplicative HIV-1 MN Souche prototype des VIH-1, moyennement réplicative HIV-2 ROD Souche prototype VIH-2, fortement réplicative CAGT Séquence nucléotidique Cytosine-AndénineGuanine-Thymidine AZT Zidovudine, Rétrovir® 3CT Lamiduvine, Epivir® PCR Polymerase Chain Reaction TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50%

Intérêts et limites de la quantification de l’ADN VIH

M. Gueudin, F. Simon

and cell lines. Viral DNA production was also compared between 44 HIV-1 and 41 HIV-2infected antiretroviral-naïve patients. Results. With all the different PBMC and the cell lines, we found a sharp difference in the DNA kinetics of the viruses: the total amount of DNA was lower with HIV-2 than with HIV1. Conversely, 2-LTR DNA appeared later with HIV-2 than with HIV-1, whereas 2-LTR DNA production rapidly became more abundant with HIV-2 than with HIV-1. In patients, the difference between HIV-1 and HIV-2 total proviral DNA loads was significant in those with CD4 cell counts above 300 CD4/μl. Conclusion. We observed early differences in total DNA production between HIV-1 and HIV2 and paradoxically, a stronger accumulation of 2-LTR circular DNA.

tase inverse (TI) contenue dans le virion entre en activité et transforme le génome ARN du virus en ADN double brin. Le VIH est capable de passer la membrane nucléaire en dehors de la phase de division grâce à la constitution d’un complexe de préintégration (PIC) composé de l’ADN VIH double brin rétrotranscript, de la protéine de matrice, de la TI, de l’intégrase et de Vpr.

Key words: HIV-2 infection, HIV-1, plasma viral load, quantitative PCR, quantification DNA.HIV-1/HIV-2. Antibiotiques 2007 ; 9 : 199-203

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la réplication virale aboutissant à la suppression de la virémie plasmatique chez les patients infectés par le VIH. Cette non-détection de l’ARN plasmatique est recherchée pour assurer un succès virologique réduisant considérablement la mortalité liée au SIDA. Devant la négativité de l’ARN lors des traitements, la quantité d’ADN proviral VIH contenue dans les cellules infectées pourrait être un marqueur de suivi particulièrement intéressant pour apprécier sur le long terme l’activité des antirétroviraux. En effet, l’intégration des ADN viraux au génome cellulaire humain, mécanisme essentiel des infections rétrovirales, assure une association stable entre l’ADN viral et l’ADN de la cellule hôte. La possibilité d’inhiber désormais l’étape d’intégration virale par une molécule inhibant l’intégrase renforce encore l’intérêt pour la quantification de l’ADN VIH.

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L’infection par VIH-2 est moins pathogène que celle par VIH-1 et les charges virales plasmatiques VIH-2 sont très inférieures à celles des infections par VIH-1. Ces différences d’histoire naturelle entre les deux infections en font un modèle d’étude idéal pour évaluer l’intérêt de la quantification de l’ADN VIH. Il nous a paru intéressant pour documenter la valeur de la quantification de l’ADN VIH, de comparer, pour ces deux infections, les quantités d’ADN produites lors d’infections expérimentales et chez des patients à différents stades d’évolution de l’infection.

Rappel sur le cycle cellulaire des VIH Lorsque le core viral pénètre dans le cytoplasme du lymphocyte, la transcrip-

Dans le noyau, l’ADN bicaténaire linéaire néoformé pourra soit être intégré dans le génome de la cellule, soit rester extra-chromosomique, se circularisant en gardant une ou deux régions LTR du génome viral (formes à 1-LTR ou 2-LTR) ou en perdant une partie du génome viral par autointégration (formes atypiques) (figure 1). Les formes à 2-LTR s’assemblent par ligation des deux extrémités du précurseur linéaire avec souvent délétion de quelques bases alors que les formes à 1-LTR s’assemblent par recombinaison homologue (figure 1). D’un point de vue quantitatif, lors d’infections in vitro en un seul cycle, l’ADN intégré représente environ 10 % de l’ADN total et les formes à 2-LTR sont très minoritaires entre 1 et 5 % [1-3]. On compte neuf formes à 1-LTR pour une forme à 2-LTR [3]. La quantification de ces formes avait été proposée comme marqueur d’une infection cellulaire récente en prenant comme

FIG. 1. — Formes prises par l’ADN viral non intégré. A. ADN double brin non intégré ; B. forme circulaire à 1LTR ; C. forme circulaire à 2LTR ; D. et E. produits d’auto-intégration (d’après Coffin JM, Hughes SH, Varmus HE. Retroviruses. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997). FIG. 1. — Various presentations of non integrated viral DNA.

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intégré [12]. Ces résultats ont été retrouvés in vitro sur des virus défectifs d’intégrase avec une production unique d’ADN extra-chromosomique, illustrée par l’accumulation des cercles à 2-LTR et l’absence de provirus intégré.

Matériel et méthodes LA QUANTIFICATION DES DIFFÉRENTES FORMES D’ADN

FIG. 2. — Les étapes du processus d’intégration : i) 3’ processing des extrémités de l’ADN viral ; ii) transfert de brin des extrémités 3’ matures de l’ADN viral dans l’ADN cellulaire ; iii) réparation de l’ADN cellulaire (d’après Coffin J M, Hughes SH, Varmus HE. Retroviruses. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997). FIG. 2. — Successive stages of the integration process.

postulat qu’elles seraient instables [4-7]. D’autres auteurs ont montré que ces formes in vitro étaient stables et pouvaient persister, leur nombre diminuant essentiellement par dilution lors de la multiplication cellulaire [8, 9]. Une dernière publication réaffirme cependant l’instabilité in vivo de ces formes en suivant le remplacement des formes circulaires non mutées par des formes circulaires portant la mutation M184V chez des patients en bithérapie AZT et 3TC [10]. L’intégration de l’ADN linéaire double brin se fait au niveau de certains sites préférentiels et commence par le clivage de deux nucléotides aux extrémités 3’ de l’ADN viral au niveau d’une séquence conservée CAGT (figure 2). Il y a formation d’extrémités cohésives aux extrémités des LTR [11]. L’intégrase (IN) virale est une protéine de 288 aminoacides capable de reconnaître des séquences spécifiques du LTR sur l’ADN rétrotranscrit et son activité de polynucléotide transférase lui permet d’agir sur plusieurs étapes de l’intégration : le 3’ processing, le transfert de brin et dans une moindre proportion la réparation qui est également assurée par des enzymes cellulaires. Hazuda et al. ont montré que les inhibiteurs d’intégrase ont pour effet d’augmenter les formes circulaires à 2-LTR, en inhibant la présence de l’ADN VIH

Pour comparer les ADN lors des infections par VIH-1 et par VIH-2 nous avons construit des standards sous forme de plasmide portant à la fois les séquences des VIH-1 et VIH-2. Deux plasmides désignés comme co-plasmides VIH-1 + VIH-2 ont été synthétisés et permettent de quantifier soit l’ADN total, soit l’ADN 2-LTR circularisé. Ces co-plasmides VIH-1 + VIH-2 ont été ensuite utilisés comme calibrateurs des réactions d’amplification génomique en temps réel (PCR) permettant une quantification strictement identique des ADN entre les deux types de VIH. Ces PCR présentent un seuil de sensibilité de 10 copies/PCR pour l’ADN total VIH-1 et de 20 copies/PCR pour l’ADN total VIH-2 et le seuil de détection des ADN circularisés avec 2-LTR est de 20 copies/ PCR pour les deux types VIH. Ces techniques ont été appliquées in vitro à la quantification des productions des ADN totaux et circularisés avec les souches HIV-1 NL4-3, HIV-1 MN et HIV-2 ROD. Un isolat primaire HIV-2 MEN d’une patiente sénégalaise symptomatique vivant en France a été également étudié. Pour chaque virus, 500 TCID50 ont été inoculés sur les PBMC de trois donneurs de sang (B1, B2, B3) et sur lignées cellulaires avec différents corécepteurs et les quantités d’ADN total et d’ADN 2-LTR circularisé produites lors de la culture ont été quantifiées par PCR temps réel. Les quantités d’ADN total ont également été comparées entre patients infectés par VIH-1 ou VIH-2 à des stades identiques de l’immunodépression et naïfs de traitement antirétroviral. Pour 44 patients infectés par le VIH-1 et 41 patients infectés par le VIH-2, les PBMC ont été recueillis sur ficoll-hypaque® et les extractions et PCR réalisées comme décrit précédemment [13].

Biologie moléculaire Résultats Les figures 3 et 4 indiquent les cinétiques de quantifications des ADN totaux et à 2-LTR respectivement sur les donneurs B1, B2, B3. Quels que soient les donneurs de PBMC et quelles que soient les souches, il existe une différence significative dans les cinétiques de l’ADN entre les deux types viraux. La quantité d’ADN total des souches VIH-2 reste significativement inférieure de 0,7 log à 1 Log entre la 6e heure et la 96e heure. Après le 6e jour le plateau est atteint pour HIV-1 et HIV-2 et la différence entre les quantités d’ADN total n’est plus significative (figure 3). Si les quantités d’ADN total VIH-1 sont supérieures aux quantités d’ADN VIH-2 jusqu’à 96 heures, les cinétiques quantitatives des formes ADN à 2-LTR sur ces mêmes prélèvements donnent des résultats opposés (figure 4) . La quantité d’ADN à 2-LTR reste plus faible avec les souches VIH-2 jusqu’à la 48e heure mais devient ensuite significativement supérieure de 1 à 1,5 Log à celle des ADN 2-LTR du VIH-1 tout au long de l’observation des cultures de PBMC et ce, quels que soient les PBMC (figure 4). Dans aucune de nos cinétiques, des cellules d’un même donneur n’ont montré un ADN VIH-2 supérieur ou égal à un ADN VIH-1 avant 96 heures. Les mêmes cinétiques ont été également réalisées sur lignées cellulaires et les résultats obtenus sur ces lignées sont identiques à ceux obtenus sur PBMC (résultats non présentés). Pour un même donneur et une même dose infectieuse, les formes à 2-LTR du VIH-2 apparaissent plus tardivement que celles du VIH-1 mais deviennent rapidement équivalentes pour les deux virus puis VIH-2 produit plus de formes à 2-LTR que VIH-1.

Comparaison ex vivo La comparaison ex vivo chez les patients confirme les différences quantitatives entre ADN VIH-1 et ADN VIH-2. Sur l’ensemble de 85 patients, 41 prélèvements des 44 patients infectés par le VIH-1 et 37 des 41 prélèvements de patients infectés par le VIH-2 sont positifs en ADN VIH total. L’analyse a été faite

201

M. Gueudin, F. Simon

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dessus de 500 CD4/μl entre VIH-1 (n = 16 [2,5 ; 2,1-2,7] et VIH-2 (n = 22 [1,6 ; 1,0-2,0].

Cinétiques sur PBMC 7.00

Log du nombre de copies d’ADN VIH /µg d'ADN total

6.00

Discussion 5.00 VIH-1 NL4-3 B1

4.00

VIH-1 NL4-3 B2 VIH-1 NL4-3 B3

3.00

VIH-2 ROD B1 VIH-2 ROD B2 VIH-2 ROD B3

2.00

VIH-2 MEN B1 VIH-2 MEN B2 VIH-2 MEN B3

1.00

0.00 0

24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336 360 384 408 432 456 480 504 528 552

Temps en heures

FIG. 3. — Évolution de la quantité d’ADN VIH total en fonction du temps sur cellules PBMC. Des cellules PBMC provenant de trois donneurs B1, B2 et B3 sont infectées par 500 TCID 50 de VIH-1 NL4-3, de VIH2 ROD et VIH-2 MEN. FIG. 3. — Evolution of total quantity of HIV-DNA as a function of time on PBMC cells.

Évolution des formes ADN à 2LTR sur PBMC

202

Formes à 2LTR en Log des copies/µg

6,00

5,00

4,00 2LTR VIH-1 NL4-3 B1

3,00

2LTR VIH-1 NL4-3 B2 2LTR VIH-1 NL4-3 B3 2LTR VIH-1 ROD B1

2,00

2LTR VIH-1 ROD B2 2LTR VIH-1 ROD B3 2LTR VIH-1 MEN B1

1,00

2LTR VIH-1 MEN B2 2LTR VIH-1 MEN B3

0,00

0

24

48

72

96

La lente pathogénicité du VIH-2 par rapport au virus de type 1 n’a pas encore trouvé d’explication définitive mais ces résultats montrent bien la correspondance entre charge virale ADN, formes circularisées et histoire naturelle. L’ensemble des travaux portant sur la réplication de ces virus confirme que les charges virales plasmatiques chez les patients infectés par VIH-2 sont très inférieures à celles observées aux mêmes stades cliniques et immunologiques chez les patients infectés par VIH-1. Inversement, les quantifications de l’ADN proviral VIH-2 chez les patients rapportaient jusque-là des valeurs d’ADN inférieures, mais de façon non significative, à celles observées lors des infections par VIH-1 [14-16]. L’absence d’outils spécifiques permettant des quantifications génomiques réellement comparables entre les deux VIH limitait l’interprétation de ces études. L’utilisation d’un calibrateur commun aux deux types de VIH et l’utilisation de la technologie en temps réel expliquent la grande reproductibilité de nos analyses et la cohérence de nos résultats par rapport à l’histoire naturelle des VIH. Les différences significatives observées dans le présent travail sont liées à l’évolution des techniques et à la standardisation des PCR rendant les amplifications réellement comparables entre elles.

120 144 168 192 216 240 264 288 312 336 360 384 408 432 456 480 504 528 552

Temps en heures

FIG. 4. — Évolution des formes circulaires à 2-LTR au cours du temps. Des cellules PBMC provenant de trois donneurs B1, B2 et B3 sont infectées par 500 TCID 50 de VIH-1 NL4-3, de VIH2 ROD et VIH-2 MEN. FIG. 4. — Evolution of circular forms of 2-LTR as a function of time.

en comparant trois groupes de patients en fonction de leur nombre de CD4/μl avec 300 et 500 CD4 comme valeurs seuils afin d’obtenir des effectifs équilibrés, les patients infectés par le VIH-2 avec moins de 200 CD4/μl et non traités étant extrêmement rares. Les valeurs médianes obtenues dans chacun des trois groupes sont systématiquement inférieures chez VIH-2. En

dessous de 300 CD4/μl, la différence entre les charges virales ADN VIH-1 (n = 16 [2,8 ; 2,2-3,2]) et VIH-2 (n = 9 [2,7 ; 2,23,3]) n’est pas significative (p = 0,8446). Elle devient significative (p = 0,0191) dans le groupe 300-500 CD4/μl entre VIH-1 (n = 12 [2,7 ; 2,3-2,8]) et VIH-2 (n = 10 [2,1 ; 1,5-2,4]). Cette différence de quantité d’ADN total devient même hautement significative (p < 0,001) au

UNE DIFFÉRENCE DE PRODUCTION D’ADN À 2-LTR ENTRE LES DEUX TYPES DE VIH

VIH-2 montre un retard initial de production pour les formes ADN circulaires à 2-LTR mais ce retard est comblé vers 48-72 heures puis VIH-2 dépasse la production du VIH-1 en forme circularisée d’ADN à 2LTR et se stabilise audessus de VIH-1. Le phénomène de ce retard de production observé chez le VIH-2 pour les formes ADN circulaires à 2-LTR est le même que celui observé pour l’ADN VIH total. Ces formes à 2LTR étant une fraction de l’ADN VIH total, ce résultat est conforme à ce qui était attendu. La suite de la cinétique est

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plus surprenante : le « rattrapage » puis le dépassement de VIH-1 par VIH-2 sont plus rapides pour ces formes circulaires que pour l’ADN total et, au plateau, les formes circulaires à 2-LTR représentent 5 à 10 % de l’ADN VIH total chez VIH-1 et 25 à 30 % chez VIH-2. Pour Butler et al. , avec des souches VIH-1, en fonction de la lignée cellulaire utilisée, le pourcentage de formes à 2-LTR varie de 1 à 5 % [8]. Cette différence entre les deux virus suggère une accumulation plus importante de ces formes dites de « déchets » chez le VIH-2. L’intégration du génome VIH-2 serait donc moins efficace chez VIH-2 que chez VIH-1. Une quantification comparée de l’ADN intégré et l’étude d’un plus grand nombre de souches seront cependant nécessaires pour confirmer notre résultat. LES DIFFÉRENCES D’ADN ENTRE VIH-1 ET VIH-2 CONFIRMÉES CHEZ LES PATIENTS

La quantité d’ADN total est significativement différente entre les patients VIH-1 et VIH-2 avec plus de 300 CD4/μl, en accord avec l’histoire naturelle de ces infections. Pour les patients ayant moins de 300 CD4/μl, nous n’avons pas mis en évidence de différence significative mais nous n’avons pas pu inclure dans notre étude de patients VIH-2 avec moins de 50 CD4/μl et non traités, ce cas de figure étant rare en France de par l’histoire naturelle de l’infection VIH-2 et l’accès au soin. Ce biais d’échantillonnage fait disparaître la significativité statistique, mais il existe une tendance à une moindre charge virale chez VIH-2 y compris au stade évolué de la maladie.

Biologie moléculaire

sur un intervalle plus faible que le marqueur ARN. Or la technique PCR ne permet pas d’interpréter des variations inférieures à 0,5 Log. Une baisse de quelques dixièmes de Log sur une échelle de moins de 3 Log n’est pas simple à interpréter. Enfin last but not the least, l’absence de trousses commercialisées limite la standardisation inter-laboratoires et la comparaison des résultats. Ces marqueurs ADN ont un avenir probable, notamment avec le développement de techniques permettant de quantifier séparément les différentes formes qui composent l’ADN total. L’approche indirecte qui consiste à quantifier les formes ADN circulaires à 2LTR est complémentaire comme le montrent nos résultats mais manque encore de sensibilité pour quantifier ces formes sur des PBMC de patients. Notre travail met bien en évidence le sens que l’on peut donner à ces marqueurs ADN totaux et circularisés et confirme les études des équipes impliquées dans l’évaluation et le développement de ce marqueur pour la prise en charge des patients [17]. REMERCIEMENTS : Ce travail a été soutenu par l’ANRS.

Clotilde Bertin, Fanny Lemerchain, Éléonore Wach, Arnaud Fleury et Sébastien Delannoy ont largement soutenu au niveau technique ce travail. Les poches de sang ont été fournies par l’IRTS de Haute-Normandie.

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