Versuche zur Kalluskultur der Sennesblätter

Versuche zur Kalluskultur der Sennesblätter

Institut fur Pharmazeutische Biologie und Phytochemie der Universidit Munster Versuche zur Kalluskultur der Sennesblatter1) HILMAR FRIEDRICH und STEF...

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Institut fur Pharmazeutische Biologie und Phytochemie der Universidit Munster

Versuche zur Kalluskultur der Sennesblatter1) HILMAR FRIEDRICH und STEFFEN BAIER Eingegangen am 24. ]uli 1972 und am 24. Oktober 1972

Summary Callus tissue from cotyledons and mature leaves of Cassia angustifolia Vahl could be induced and isolated on a complex medium containing the salt solution of MURASHIGE and SKOOG (1962), vitamins (REINERT and WHITE, 1956), amino acids (KOBLITZ, 1967), and supplemented with coconut milk (15 0/0). 2,4-D proved to be best suited for callus induction and growth within the range of 3,0 to. 5,0 ppm with kinetin (0,05 ppm). Without coconut milk neither callus induction nor subculturing were possible. Whereas the callus from cotyledons could be subcultured easily, all attempts to maintain the growth of the cultures derived from mature leaves failed. With respect to the strong darkening of the cultures, the observed inhibition of callus growth is probably due to the activity of polyphenol oxidases. However, all attempts to overcome these difficulties in using copper-free media combined with polyphenol oxidase-inhibitors (phenylthiourea) or copper-chelating substances (6-methyl-2-pyridine-aldoxime; HARTKAMP, 1960) were unsuccessful. Only use of conditioned media together with nursetissues provided some promising starting points for future working. The growth characteristics of the callus derived from cotyledons were studied under different conditions, i. e. varying nutritional and physical factors. No differences were observed between the tissues when cultured in light or darkness. In contrast to the extreme sensitivity of intact plants to cold, the cultures tolerate low temperatures (+ 3° C) for several months, without losing their ability to grow. Replacement of 2,4-D by IAA or NAA led to the formation of tissues differing partly in shape and colour from the stock cultures, but which could not be maintained indefinitely on the same media. No differentiation phenomena could be observed, even when the auxin-kinetin relation of 2,4-D, IAA- or NAA-media was varied. Addition of gibberellic acid caused a complete and irreversible cessation of growth. After the omission of coconut milk, the growth rate slowed 90wn too, but could be further stimulated by a reversion on standard medium. Likewise, neither vitamins nor amino acids could be taken away.

Einleitung

Trotz der groBen Anzahl synthetischer Praparate gehoren die Sennesblatter auch heute noch zu den meist benutzten Abflihrmitteln. Den ihrer Anwendungsbreite entsprechenden groBen Bedarf decken im wesentlichen die Anbaugebiete in Vorderindien. Es ist naheliegend, daB mit einer Veranderung der politischen Lage in diesen Anbaugebieten auch eine Verknappung des Weltmarktes bezliglich dieser Droge einhergehen kann. So muBten im 2. Weltkrieg Freilandkulturen von Senna im Sliden der USA angelegt werden (GROTE und WOODS, 1951). Da ein Freilandanbau in unseren Breiten 1) Teil der Dissertation S. BAIER, Munster 1971.

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auf Grund der groBen Kalteernpfindlichkeit der Pflanzen nicht rnoglich und eine Anzucht im Gewachshaus schwierig und unrentabel ist, war es von Interesse, die Einsatzrnoglichkeiten der pflanzlichen Gewebe- bzw. Kalluskultur-Technik fur diesen Zweck zu untersuchen, d. h. zu priifen, ob es gelingt, das Blattgewebe von Senna in vitro zu kultivieren.

Material und Methoden 1. Herkunjt und Isolierung der Kulturen

Ausgangsmaterial waren aseptisch herangezogene Keimpflanzen von Cassia angustijolia Vahl und Gewachshauspflanzen der gleichen Art, deren Blatter durch Oberflachensterilisation keimfrei gemacht wurden. Zur Aufzucht der Keimpflanzen wurde Saatgut2) durch kurzes Eintauchen in Athanol (96 0/0) und nachfolgendes Einlegen in 10 % Natriumhypochloritlosung wahrend 10 Min. keimfrei gemacht, dreimal mit sterilem Wasser gewaschen und schlieBlich in feuchte Petri-Schalen gelegt, wo es bis zur Entwicklung der Keimpflanzen verblieb. Die Sekundarblatter wurden fiir 1-2 Min. in 2,5 % Natriumhypochloritlosung getaucht, danach mehrmals mit sterilem Leitungswasser gewaschen. 2. Nahrmedien

Die Zusammensetzung cler Mineralsalzlosung erfolgte nach den Angaben von MURASHIGE und SKOOG (1962), die Auswahl der Vitamine in Anlehnung an REINERT und WHITE (1956), die der Aminosauren nach KOBLITZ (1967). Die verwendete Kokosmilch wurde Handelsfriichten entnommen und bei Bedarf 150,0 ml je Liter verwendet. Die Nahrmedien wurden durch den Zusatz von 40,0 g/l Saccharose und 10,0 g/l Agar erganzt. Zum Einsatz kamen die folgenden Wuchsstoffe innerhalb des angegebenen Konzentrationsbereiches: ..... fJ-Indolylessigsaure (IES) 0,10-10,0 mg/l -a-Naphthylessigsaure (NES) 0,10-10,0 mg/l ..... 2,4-Dichlorphenoxyessigsaure (2,4-D) 0,01-10,0 mg/l ..... 6-Furfurylaminopurin (Kinetin) 0,01-10,0 mg/l ..... Gibberellin A 3 (Gibberellinsaure) 0,01-10,0 mg/l Die Nahrmedien wurden mit N/l0 NaOH auf pH 5,8 eingestellt und 30 Min. bei 120° C und 1 atii sterilisiert. Die thermolabile Gibberellinsaure wurde in 50 % Athanol den Nahrmedien nach dem Autoklavieren zugesetzt. Zur Subkultivierung des Sekundarblatt-Kallus wurden die Substrate ohne Kupfersulfat bereitet, die in der Mineralsalzlosung als Verunreinigung anderer Komponenten enthaltenen Kupferspuren durch den Zusatz von 1,0 mg/l Phenylthioharnstoff oder 6-Methyl-2-pyridinaldoxim gebunden. In einigen Fallen erfolgte die Entfernung der Kupferspuren auch durch Behandlung der Mineralsalzlosung mit 6-Methyl-2-pyridin-aldoxim nach HARTKAMP (1960). 3. Kulturbedingungen Die Subkultivierung erfolgte in 3-4wochigem Rhythmus. Die KulturgefaBe (300,0-mlErlenmeyerkolben, beschickt mit 100,0 ml Substrat) wurden in Brutschranken bei 30° C aufbewahrt, teils im Licht (Bestrahlung im 12-h-Rhythmus mit 100-W-Birnen in Reflektoren), teils unter LichtabschluB.

2) Das Saatgut wurde von den Firmen ROHA-Werk, Bremen, und A. Nattermann & Cie., Koln, freundlicherweise zur Verfiigung gestellt. Beiden Firmen sei dafiir herzlich gedankt.

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Ergebnisse 1. I nitialkultur KeimbHitter und SekundarbHitter wurden auf unterschiedlich zusammengesetzte Nahrboden explantiert und ihre Reaktion gegeniiber verschiedenen Wuchsstoffen untersucht (BAIER, 1971). Infolge des hohen Differenzierungsgrades der Explantate fiihrten nur die vollstandigen Nahrmedien mit Vitaminen und Aminosauren zu einer Weiterentwicklung. Entscheidend war der Zusatz von Kokosmilch, ohne die weder eine Kallusinduktion noch eine erfolgreiche Subkultivierung moglich war. Keimblatter und Sekundarblatter reagierten auf die applizierten Wuchsstoffe in gleicher Weise. Zur Kallusinduktion bewahrte sich 2,4-D (3,0-5,0 mg/l): die starke kallogene Wirkung des Wuchsstoffs in diesem Konzentrationsbereich stellte sich mit wenigen Ausnahmen unabhangig von gleichzeitig vorhandenem Kinetin bzw. Gibberellin ein, so daB diesen Verbindungen bei der Kallusinduktion nur eine sekundare Rolle zufallen diirfte. In niedriger Dosierung (0,05 mg/l Kinetin bzw. 0,5 mg/l Gibberellin) beschleunigten sie jedoch in Verbindung mit der optimalen 2,4-D-Konzentration die Induktion und das Wachstum eines Primarkallus. In hoherer Konzentration wirkten sie dagegen deutlich wachstumshemmend. Das Licht iibte keinen EinfluB auf Bildung und Wachstum der Gewebe aus: Der V,ergleich zwischen Licht- und Dunkelkulturen ergab bis auf eine geringfiigige Verzogerung in der Entwicklung der Dunkelkulturen vergleichbare Ergebnisse.

2. Kalluswachstum

Zur Anlage von Stammkulturen wurden die yom Explantat abgetrennten Primarkalli mit 4,0 mg/12,4-D und 0,05 mg/1 Kinetin weiterku1tiviert.

2.1. Kotyledonarkallus Der Kotyledonarkallus entwickelte sich auf den frischen Substraten weiter zu einem verhaltnismaBig kompakten, grobkornigen, aus langgestreckten Zellen bestehenden Gewebe von hellbrauner bis -grauer Farbe, das auch bei Dauerbelichtung nur in Ausnahmefallen Ansatze zur Chlorophyllbildung zeigte. Die Subkultivierung der Gewebe erfolgte aIle 4 Wochen. Innerhalb einer solchen Passage war bei den Explantaten mit einem mittleren Frischgewicht von 2,30 ± 0,30 g eine mittlere Gewichtszunahme von 12,47 ± 2,80 g zu verzeichnen. Der Ersatz der Mineralsalzlosung nach MURASHIGE und SKOOG (1962) durch die Losungen von HELLER (1953) bzw. WHITE (1963) fiihrte wie die Subkultivierung auf kokosmilch-freien Substraten nach einigen Passagen zu einer merklichen Wachstumsverminderung, die durch die Riickiibertragung auf das Standardmedium wieder aufgehoben wurde, andernfalls jedoch zum Absterben der Gewebe fiihrte. In gleicher Weise konnte auf den Zusatz von Vitaminen und Aminosauren nicht verzichtet werden.

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2.2. Sekundarblatt-Kallus Die Subkultivierung des Sekundarblatt-Kallus lieE sich unter den beschriebenen Bedingungen nicht durchftihren: Kurz nach der Obertragung auf den frischen Nahrboden starb der Primarkallus unter Schwarzfarbung ab, einige nachtraglich gebildete Kallusstticke folgten in kurzem zeitlichem Abstand nacho Diese Erscheinung trat unabhangig von der Zusammensetzung des Nahrmediums auf, so daB ein EinfluB des Kinetins auf die Pigmentierung (NITSCH und STRAIN, 1969) ausgeschlossen wurde. So wurde, vor allem auf Grund der auffallenden Pigmentierung der Gewebe, der EinfluB von Polyphenoloxidasen vermutet, tiber den verschiedentlich berichtet wurde (FORREST, 1969; KOBLITZ et aI., 1967; STEINHART, 1962). KOBLITZ et ai. konnten die damit verbundenen Wachstumsschwierigkeiten durch den Einsatz reduzierender Stoffe in Verbindung mit kupferfreien Substraten iiberwinden. Doch ftihrten die von ihnen empfohlenen Versuchsvarianten weder zur Unterdriickung der Pigmentbildung noch zur Aufrechterhaltung des Kalluswachstums. Durch den Einsatz von Kotyledonarkallus als «Ammengewebe» in Verbindung mit konditionierten Substraten gelang es schlieBlich, Bedingungen zu schaffen, unter denen sich der ausgesetzte SekundarblattKallus sehr lebhaft, jedoch unter Beibehaltung seiner dunklen Farbe weiterentwickelte. Eine Subkultivierung des neugebildeten Gewebes ohne Ammengewebe gelang auf frischen Nahrmedien nicht.

3. Kalluswachstum unter veranderten Kulturbedingungen 3.1. EinfluB von Licht und Temperatur Wie schon bei der Initialkultur lieB sich ein EinfluB des Lichtes auf Wuchsform und Wachstumsrate der Gewebe im Verlauf der Subkultivierung nicht belegen. Lediglich bei Dauerbelichtung wurde bei Zusatz geringer Kinetinmengen eine Tendenz zur Bildung von Chlorophyll bei einigen Geweben festgestellt. In gleicher Weise indifferent reagierten die Gewebe auf den EinfluB tiefer Temperaturen. Entsprechende Versuche zeigten, daB sie einen dreimonatigen Aufenthalt im Ktihlhaus bei etwa + 3 0 C unbeschadet iiberstehen konnen und sich nach der Dbertragung in den Brutschrank wieder in gewohnter Weise und ohne Anderung ihrer Wuchsform weiterentwickeln.

3.2. EinfluB von Wuchsstoffen Der Ersatz der 2,4-D durch IES und NES, einzeln und in Kombination mit Kinetin, fiihrte zur Neubildung von Kallusgeweben, die sich im wesentlichen in der Farbe und durch die isodiametrische Form der Zellen von den Stammgeweben unterschieden. Fiir ·die Subkultivierung der Kalli eigneten sich beide Wuchsstoffe jedoch nicht. Die Mehr·zahl der Kulturen starb bereits im Veriauf der ersten Passage ab und nur IES wirkte in verhaltnismaBig hoher Konzentration (5,0 bis 10,0 mg/l) in Verbindung mit 0,1 bis 0,5 mg/l Kinetin wachstumsfordernd tiber einige Passagen. Differenzierungen traten trotz der Verschiebung des Konzentrationsverhaltnisses zwischen Auxinen und Kinetin (REINERT, 1968; SKOOG und MILLER, 1957) an den Kulturen nicht auf. In gleicher

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Weise fuhrte der Einsatz des Kinetins in versehiedenen Konzentrationen bei einem konstanten 2,4-D-Gehalt von 4,0 mg/l gewohnlieh zu einem kraftigen, grobkornigen Kallus von einheitlieh schwaeh gelber Farbe. Der Einsatz von Gibberellinsaure bei der Subkultivierung der Stammgewebe fuhrte bei jeder Konzentration zu einer vollstandigen Waehstumshemmung, die aueh durch die Obertragung der Gewebe auf gibberellinfreie Nahrboden nieht wieder aufgehoben wurde.

Diskussion Die besehriebenen Waehstumsversuehe haben gezeigt, daB Kotyledonen und Sekundarblatter von Senna auf exogen applizierte Wuchsstoffe in gleieher Weise, aueh bezuglieh der Ausbildung von Kallusgeweben reagieren. Wahrend sieh jedoeh der Kotyledonarkallus unter nur geringfugiger Veranderung seiner Wuehsform unter den besehriebenen Kultivierungsbedingungen erhalten und vermehren laBt, ist die Kultivierung des Sekundarblatt-Kallus problematisch. Worauf die gesehilderten Waehstumssehwierigkeiten letztlieh zuruekzufuhren sind, laBt sieh auf Grund der experimentellen Befunde noeh nieht sieher entseheiden. Die erfolgreiehe Anwendung konditionierter Nahrmedien in Verbindung mit «Ammengeweben» laBt jedoeh zunaehst auf das Fehlen eines Verbandes funktionstuehtiger Zellen an der Peripherie des Kallus sehlieBen, wodureh die fur den Obergang der Kulturen in die exponentielle Waehstumsphase entscheidende Konditionierung des Substrates unterbleiben durfte (CONSTABEL und KIRSTEN, 1965; REINERT, 1965; STREET, 1966). Obwohl entsprechende Versuche mit reduzierend wirkenden Substanzen, Polyphenoloxidase-Inhibitoren und Kupfer-Chelat-Bildnern sowie in diesem Sinne modifizierten t~ahrmedien erfolglos waren, bleibt dennoch der Verdacht bestehen, daB fermentative Prozesse, namentlich der EinfluB von Polyphenoloxidasen, als eine der Ursachen ftir die Zellenschadigung anzusehen sind. Der Kotyledonarkallus erwies sich im Verlauf seiner Subkultivierung unter teilweise veranderten Kulturbedingungen als ein gegentiber auBeren und inneren Faktoren indifferentes Objekt. Die eingesetzten Wuchsstoffe vermochten zwar die Wachstumsrate, nicht aber die Wurchsform der untersuchten Gewebe in signifikanter Weise zu beeinflussen. Da die physiologischen GesetzmaBigkeiten der Organbildung aus undifferenziertem pflanzlichem Gewebe trotz einer Vielzahl von Untersuchungen an Kalluskulturen immer noch ungenugend bekannt sind, entzieht sieh dieser Befund noeh einer befriedigenden Deutung (REINERT, 1968; STREET, 1966 a). Obwohl sich eine Differenzierung einzelner Zellen oder Zellgruppen damit nicht ausschlieBen laBt, ist diese Indifferenz der Gewebe, selbst unter stark veranderten ehemischen und physikalisehen Kultivierungsmethoden, fur die angestrebte Zielsetzung zunachst eher von Vorteil, unter der Voraussetzung, daB das Gewebe hinsichtlich der Biosynthese sekundarer Inhaltsstoffe yom Differenzierungsgrad unabhangig ist. Eine endgultige Aussage tiber das weitere Verhalten der Gewebe ist aufgrund der bekannten Varia-

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bilidit pflanzlicher Kalluskulturen zum jetzigen Zeitpunkt allerdings nicht moglich, und es muB mit einem modifizierten Wachstumsverhalten der Kulturen im weiteren VerIauf ihrer Subkultivierung gerechnet werden. Wir danken der Fa. ROHA-Werk, Bremen, fur die finanzielle Unterstutzung dieser Arbeit.

Literatur BAIER, S.: Diss., Munster (1971). CONSTABEL, F., und G. KIRSTEIN: Ber. dtsch. bot. Ges. 78 (38) (1965). FORREST, G. I.: Biochem. ]. 113, 765 (1969). GROTE, I. W., und 11. WOODS: ]. Amer. Pharmac. Ass., Sci. Ed. 40, 52 (1951). HARTKAMP, H.: Z. analyt. Chemie 176, 185 (1960). HELLER, R.: Ann. Sci. nat., Bot. BioI. veg. 14, 1 (1953). KOBLITZ, H.: 'Qual. Plantar. 14, 70 (1967). KOBLITZ, H., K.-D. GRUTZMANN und I. HAGEN: Z. Pflanzenphysiol. 56,27 (1967). MURASHIGE, T., und F. SKOOG: Physiol. Plantar. 15, 473 (1962). NITSCH, ].-P., und G. C. STRAIN: C. R. Acad. Sci. 268, 806 (1969). REINERT, ].: Ber. dtsch. bot. Ges. 78 (1) (1965). - Naturwiss. 55, 170 (1968). REINERT, ]., und PH. R. WHITE: Physiol. Plantar. 9, 177 (1956). SKOOG, F., und C. O. MILLER: Symp. Soc. Exp. BioI. 11,118 (1957). STEINHART, C. E.: Science 137, 545 (1962). STREET, H. E.: in E. N. WILLMER, Cells and Tissues in Culture. III. Academic Press, LondonNew York (1966), 533. - in E. N. WILLMER, Cells and Tissues in Culture. III. Academic Press, London-New York (1966 a), 631. WHITE, PH. R.: The Cultivation of Animal and Plant Cells. New York (1963). Prof. Dr. HILMAR FRIEDRICH, Institut fur Pharmazeutische Biologie und Phytochemie der Westf. Wilhelms-Universitat, D-44 l\1unster, Hittorfstr. 56.

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