Zur wirkung der circadianen Rhythmik auf die Entwicklung von Drosophila

Zur wirkung der circadianen Rhythmik auf die Entwicklung von Drosophila

J. Znsect Physiol., 1967,Vol. 13,pp. 1547to 1568.Pergamon Press Ltd. Printed in Great Britain ZUR WIRKUNG DER CIRCADIANEN RHYTHMIK DIE ENTWICKLUNG VO...

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J. Znsect Physiol., 1967,Vol. 13,pp. 1547to 1568.Pergamon Press Ltd. Printed in Great Britain

ZUR WIRKUNG DER CIRCADIANEN RHYTHMIK DIE ENTWICKLUNG VON DROSOPHILA” LUDGER

RENSING

und

ReDIGER

HARDELAND

1 Zoologisches Institut der Universitlt (Received

4 April

AUF

Gattingen

1967)

Abstract-Egg-laying shows a daily periodicity. In a 12 : 12 hr day a main maximum occurs shortly after dusk, a smaller one at noon. In a population the number of newly made prepupae reaches a maximum at dusk and a minimum in the morning of a 12 : 12 hr day. The rhythm of puparium formation can be shifted relative to the natural day by shifting the artificial light-dark rCgime. After a single egg-laying period of 12 hr this rhythm remains manifest. Drosophila Victoria shows a more and D. hydei a less pronounced rhythm of puparium formation compared with D. melfnogusteu. In constant light of 7 lx the rhythm of D. victoriu, which has been tested under this condition, lasts at least for 3 days. The effects of changes in temperature, in the light-dark ratio, and in the age of the culture, as well as the addition of drugs have been analysed. Benzamide 0.1% reduces the differences between maximal and minimal values to onequarter of those of the controls, whereas 0.2% 2,4_dinitrophenol has no effect. The mean values of the puff indices of the chromosome region 74-78 reach a maximum in the third instar larvae 3 to 6 hr after the beginning of the light time in a 12 : 12 hr day. Prepupae formed in the morning pupate after 18 hr (1 SS’C), whereas those formed in the afternoon need 19 to 20 hr to pupate. The puffing pattern of the chromosome region 85 C-F shows no differences in both groups. In constant light of 30 lx the interval in the developmental process from the formation of prepupae to the emergence of adults is independent of the daily periodic

beginning

of the development

(18*5”C).

EINLEITUNG DIE ROLLE des

circadianen

Schritte

oder

wenigen

Fsillen untersucht

fens

Insekten

bei

Teilprozesse

%iel, Aufschluss der

der

worden.

h%ufig beobachtet

tierung

auf

die

zeitlichen

der

Festlegung

Organismen

und analysiert, liegenden

doch

circadianen

einzelner

ist bisher

Zwar hat man die Tagesperiodik

Dauer

Dabei zwei Entwicklungsmarken

von dem tageszeitlichen

* Mit Unterstiitzung

der

vorwiegend Rhythmus

nur

in

des Schliipmit

dem

zu erhalten

BRETT, 195.5). Als erste ist HARKER(1965) der Frage nach dem

Rhythmik

Drosophila nachgegangen. zwischen

bei

Ontogenese

iiber den zugrunde

(PITTENDRIGH, 1954; Einfluss

Rhythmus

Beginn

der Deutschen

bestimmter

Entwicklungsabschnitte

bei

ergab sich eine Abhnngigkeit der Zeitdauer wie Vorpuppenbildung und Augenpigmender Vorpuppenh5utung.

Forschungsgemeinschaft. 1547

1548

L. RENSINGUNDR. HARDELAND

Da bei Drosophila sowohl in Hinblick auf ihren Schliipfrhythmus (PITTENDRIGH, 1966) als such auf die Rhythmen des Stoffwechsels und der Hormontntigkeit (RENSING, 1966a, b) eine Reihe von Ergebnissen vorliegen, schien es uns lohnend, an diesem Objekt weitere Versuche zu unternehmen, urn den Zusammenhang zwischen Entwicklung und circadianer Periodik zu k&en. Dabei stand einmal die Frage im Vordergrund, ob es ausser dem Schliipfen noch andere Entwicklungsschritte g%be, die vorwiegend oder ausschliesslich an eine bestimmte Tageszeit gekniipft sind. Wir wandten uns bei dieser Fragestellung vor allem der Vorpuppenund Puppenhsutung, sowie dem Auftreten bestlmmter entwicklungsspezifischer Puffs in den Speicheldriisenchromosomen zu, da hier unmittelbare Zusammenhnnge mit hormonellen Verlnderungen bestehen (BECKER, 1959, 1962; CLEVER, 1961). Zur nsheren Analyse des Rhythmus dieser Entwicklungsschritte war such zu k&en, ob er unabhnngig von dem Rhythmus der Eiablage auftritt, durch welche Zeitgeber er sich steuern 1Hsstund wie er sich unter verschiedenen Umweltbedingungen (Temperatur, Licht, Pharmaka) verhglt. Zum anderen interessierte uns, in welcher Weise das Interval1 Vorpuppenbildung-Verpuppung von dem Zeitpunkt der Vorpuppenbildung abhtingt. Neben den Unterschieden in der Entwicklungsdauer sollte dabei such auf magliche Unterschiede im Puffmuster geachtet werden. Ausserdem wollten wir prtifen, ob such in konstantem Licht die Dauer der gesamten Puppenentwicklung und das Schliipfen vom tageszeitlichen Beginn des Vorpuppenstadiums abhlngt. Schliesslich war zu diskutieren, in welcher Weise man die neueren Befunde an Drosophila (HARKER,1965; PITTENDRIGH,1966) mit unseren eigenen Ergebnissen in Zusammenhang bringen kiinnte. MATERIAL UND METHODEN In den Versuchen verwendeten wir hauptsnchlich Tiere eines Wildstammes von Drosophila melanogaster Meigen aus dem biologischen Institut der Universitit Princeton, N.J. (U.S.A.), d ie iiber ein Jahr ingeziichtet worden waren. Zum Vergleich haben wir einmal D. hydei und D. Victoria herangezogen, die uns freundlicherweise von Dr. Berendes (Leiden) zur Verfiigung gestellt wurden. Urn den Tagesgang der Eiablage zu verfolgen, hielten wir etwa 100-200 Imagines in Populationskhten aus Kunststoff (16 x 13 x 11 cm), in die zur normalen Emahrung mit Zucker-AgarlGsung durchtrgnkte Watterollen hineingeschoben werden konnten. Zur Gewinnung der Eier ersetzten wir einige davon durch lange Messingschrauben mit einer anhaftenden Hefesuspension. Die dort bevorzugt abgelegten Eier konnten dann leicht mit einem Wasserstrahl abgespiilt und auf einem Filter aus Baumwollstoff aufgefangen werden; anschliessend wurden die Eier getrocknet und gewogen. Bei der Bestimmung der zu den verschiedenen Tageszeiten neu gebildeten Vorpuppen benutzten wir die normalen Zuchtflaschen (250 ml Inhalt) mit Normalmedium (_vgl. SPENCER,1950) oder einem Medium nach DAVID(1959) und liessen 20-30 Fhegen dort fiir 12 Std. oder mehrere Tage ihre Eier ablegen.

ZURWIRKUNG DERCIRCADIANEN RHYTHMIK VONDROSOPHILA

1549

WPhrend der Zeit der Vorpuppenbildung zHhlten wir entweder in Abstbden von 2-3 Std. die neugebildeten, noch unpigmentierten Puparien an der Gefssswand oder sammelten alle in dieser Zeit gebildeten Vorpuppen ab. Im ersten FalI war in der Dunkelzeit jeweils eine 5 miniitige Belichtung zur Identifizierung der neuen Puparien niitig, im zweiten Fall konnte das Absammeln bei jeweils in der Dunkelzeit konstant angeschaltetem Rotlicht vor sich gehen. Da die Zahl der gebildeten Vorpuppen je nach der Menge der abgelegten Eier und je nach dem Alter der Kultur sehr unterschiedlich ist, berechneten wir bis auf einige Beispiele mit absoluten Werten die Zahl der Vorpuppen in Prozent der Tagessumme. Die Wirkung von Benzamid untersuchten wir an Kulturen, denen entsprechend den Angaben von ABD EL WAHAB(1959) und ABD EL WAHABund SIRLIN (1959) O,l% dieses Stoffes dem Futter beigegeben war, wghrend die Konzentration von 2,+Dinitrophenol im Medium 0,2% betrug. Zur Bestimmung der Dauer des Vorpuppenstadiums bei 18,5”C sammelten wir wihrend der Hellzeit jede Stunde Vorpuppen ab und hielten sie dann in Petrischalen auf feuchtem Filtrierpapier. Der Zeitpunkt der Verpuppung liess sich an dem Ausstiilpen des Kopfes eindeutig festlegen. Ebenso gingen wir bei der Untersuchung der Dauer der gesamten Vorpuppen- und Puppenentwicklung vor: wHhrend der Hellzeit sammelten wir alle 3 Std. die frisch gebildeten Vorpuppen und zlhlten dann wlhrend der Schliipfzeit alle Stunde die geschliipften Tiere. Urn das Puffmuster vor der Vorpuppenbildung zu untersuchen, sammelten wir jeweils eine bestimmte Anzahl von Larven des 3. Stadiums von den Diese Larven befinden sich zum grijssten Teil Wgnden des Kulturgefisses. in der ‘Wanderphase’, d.h. am Ende des 3. Larvenstadiums, kehren aber such gelegentlich noch in das Medium zuriick. Die Speicheldriisen der abgesammelten Larven wurden dann in einem Essigsgure-MilchsHure-Orcein-Gemisch (NICOLETTI, 1959) gequetscht und die Ausbildung der Puffs auf der Region 74-78 bestimmt. Ein der Puffentwicklung entsprechender Index von l-10 (BECKER,1959) diente zur Darstellung des Mittelwertes jeder Stichprobe. Den Verlauf des Puffmusters wghrend des Vorpuppenstadiums bei 18,5”C verfolgten wir an einer anderen Region (85 C-F), wobei in diesen Versuchen das Alter nach der Vorpuppenbildung gut bekannt war. In den Quetschprlparaten der Chromosomen massen wir jeweils mit einem zeichenapparat die griisste Breite der puffbildenden Region und von einer der angrenzenden dunklen Banden. Aus diesen beiden Werten berechneten wir jeweils den Quotienten, urn die Unterschiede im Polytgniegrad und in der mechanischen Quetschung auszugleichen. BEFUNDE Eiablage

Mit dem Entwicklungszyklus der Larven hat die Eiablage nur einen mittelbaren Zusammenhang; nicht einmal das Schliipfen der Larven aus dem Ei hat eine feste Beziehung zum Zeitpunkt der Eiablage, da die Eier in verschiedenen ‘?9

1550

L. RENSING UND R. HARDELAND

Entwicklungsstadien abgelegt werden. Immerhin ist der Beginn der Entwicklung fur eine Mehrzahl der Eier wahrscheinlich gleichzeitig, so dass das Argument nicht von der Hand zu weisen ist, die Rhythmik der Eiablage kiinne die Rhythmen der Hautungen oder anderer Entwicklungsschritte zur Folge haben, wenn die Entwicklung einigermassen synchron verliefe (vgl. HARKER, 1965). Zur Klarung dieser moglichen Zusammenhange untersuchten wir zunachst den Rhythmus der Eiablage, indem wir die zu verschiedenen Tageszeiten abgelegten Eier sammelten und das jeweilige Trockengewicht betimmten.

a

1 b

3

6

9

12

15

18

21

24

3

6

h

hB. 1. Eiablage bei unterschiedlichen Licht-Dunkel-Vertiltnissen und einer Temperatur von 20°C. (a) 4 : 20 Std., (b) 12 : 12 Std., (c) 20 : 4 Std. Ordinate: Trockengewicht der Eier in mg; Abszisse: Tageszeit; teilweise doppelt aufgetragen.

ZUR WIRKUNG

DER CIRCADIANEN

RHYTtIMIK

VON

1551

DROSOPHILA

Aufhallig ist vor allem das abendliche hohe Maximum, das in einem 12 : 12 Std.-Tag in die ersten Stunden der Dunkelheit fallt (Abb. lb). In den veranderten Hell-Dunkel-Verhaltnissen eines 4 : 20 Std. und 20 : 4 Std.-Tages (Abb. la, c) verandert dieses Maximum seine Lage in bezug auf den Beginn der Dunkeloder Hellzeit erheblich, relativ wenig dagegen in bezug auf die Mitte der Helloder Dunkelzeit. Ein kleineres Maximum scheint kurz vor der Mitte der Hellzeit vorhanden zu sein, zumindest in Abb. lb, c. Je nach der jeweils herrschenden Temperatur ist also zu einer bestimmten Tageszeit ein durch das Maximum der Eiablage indirekt hervorgerufenes Maximum des Schliipfens aus dem Ei zu erwarten. Vergleicht man den Eiablagerhythmus mit anderen Tagesrhythmen von Drosophila-Imagines, so zeigt sich, dass die Maxima der Eiablage ungefahr mit den Minima der Aktivitat und des Sauerstoffverbrauches zusammenfallen (RENSING, 1965q 1966a). Das stimmt mit Verhaltensbeobachtungen iiberein, wonach die Weibchen bei der Eiablage meist ruhig auf dem Futtermedium sitzen.

b

0

3

6

9

12

15

18

21

24

3

6

h

2. Pupariumbildung bei unterschiedlicher Lage des Kunsttages von 12 : 12 Std. LD und einer Temperatur von 25°C. Ordinate: Prozentzahl der frisch gebildeten Puparien bezogen auf die Summe des Tages; Abszisse: Tageszeit; teilweise doppelt aufgetragen. ((a) n = 2630; (b) n = 385.)

&3B.

15.52

L. RENSINCUND R. HARDELAND

Pupariumbildung Die Pupariumbildung ist ausserlich an dem Festsetzen der Larven an der Gef&swand, einer geringen Verkiirzung der Kiirperlange und dem Ausstrecken der sogenannten ‘Spirakeln’ erkennbar. Etwa eine halbe Stunde spater(25”C) farbt sich das urspiinglich heile Puparium braun, so dass man innerhalb dieses Zeitraumes gut die neu gebildeten Puparien erkennen kann. Mit diesen ausserlich sichtbaren Veranderungen geht die Vorpuppenhautung vor sich. Zunachst untersuchten wir Kulturen, bei denen die Eier iiber mehrere Tage hinweg abgelegt worden waren, und stellten durch 2-3 stiindiges Zahlen der neugebildeten Vorpuppen fest, dass in einer solchen Population die Zahl der jeweils zu bestimmten Tageszeiten gebildeten Vorpuppen unterschiedlich ist : am Ende der Lichtzeit eines 12 : 12 Std.-Tages erreicht sie ein Maximum (Abb. 2a). Urn die Mijglichkeit auszuschliessenn, dass tagesperiodische Anderungen des atmospharischen Luftdrucks (LINKE, 1940; RENSING, 1966a) oder andere periodische geophysikalische Faktoren diesen Rhythmus hervorrufen, verschoben wir den Licht-Dunkel-Wechsel urn 6 Std. gegeniiber dem natiirlichen Tag. Dabei zeigt sich, dass der Rhythmus der Pupariumbildung dieser Verschiebung folgt (Abb. 2b), also vom Licht gesteuert wird. Noch nicht geklart ist dabei die miigliche Rolle des Eiablagerhythmus (s. S. 1549). Aus diesem Grunde liessen wir in einem Versuch die Weibchen nur fiir 12 Std. ihre Eier auf dem Substrat ablegen und sammelten nach der Larvenentwicklung die Vorpuppen alle 2 Std. ab. Wie Tabelle 1 belegt, erstreckt sich die Pupariumbildung iiber 3-4 Tage. Die Streuung der Entwicklungsdauer ist also so gross, dass eine Schlupfrhythmik der Larven aus dem Ei bis zur Vorpuppenbildung vollig verwischt sein miisste. Dasselbe bestatigen Versuche mit Larven, die alle gleichzeitig

0

3

6

9

12

15

18

21

24

3

3. Pupariumbildung nach 12stiindiger Eiablage im Kunsttag von 12 : 12 Std. LD bei einer Temperatur von 25°C. Ordinate: Prozentzahl der in jeweils 2 Std. gebildeten Puparien bezogen auf die Summe von 3 Tagen; Abszisse: Tageszeit; teilweise doppelt aufgetragen. (n = 2366.)

AEXB.

Tag Tag Tag Tag 119 62 18

9-11

113 84 11

11-13

Tag Tag Tag Tag Tag Tag

17-19 0 0 1 0 1 0

2 1 0 1 2 0 0 4 0 0 0 3

0 0 0 0 0 0

21-23 0 0 0 0 0 0

23-l

2--VORPUPPENBILDUNG

19-21

TABELLE 15-17

123 92 20

0 3 0 0 0 0

1-3

BEI

Tag Tag Tag Tag Tag Tag

0 3 5 4 17 30

15-17 0 4 5 8 2.5 15

17-19

21-23 3 4 7 14 19 20

19-21 0 5 5 19 13 21

0 2 6 17 19 20

23-l

3-VORPUPPENBILDUNG

2 2 7 13 15 12

1-3

0 1

2 4 16 15 11 17

:;t 17 22

5-7

3-5

hydei

1 16 10 11 7 19

1 11 3 0 2 4

BEI Drosophila

LD 12 : 12 ; Hell-Dunkel-Wechsel 15.00 und 3.00 Uhr. 18,S”C. Angegeben ist die Zahl der in jeweils zwei Stunden gebildeten Vorpuppen.

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Uhrzeit

TABELLE

5-7

3-5

Drosophila

5 12 12 17 16 23

7-9

25 67 33

3 5 10 9 11 15

7-9

Victoria

44 92 57

20 106 75

l-3

5 7 14 8 8 13

9-11

5 9 16 27 13 13

9-11

50 85 28

3-5

4 1 23 32 2 2

11-13

87 91 2.5

5-7

4 7 11 8 13 14

11-13

KURZZEITIGER EIABLAGE 23-1

NACH

21-23

Vorpuppen.

124 57 15

19-21

LD 12 : 12; Hell-Dunkel-Wechsel 15.00 und 3.00 Uhr. 18,S”C. Angegeben ist die Zahl der in jeweils zwei Stunden gebildeten Vorpuppen.

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Uhrzeit

120 86 15

17-19

Drosophila welanngaster

15-17

BEI

und 21 .OO Uhr. 25°C. zwei Stunden gebildeten

98 107 14

13-15

I-VORPITPPENBILDUNG

LD 12 : 12; Hell-Dunkel-Wechsel9.00 Angegeben ist die Zahl der in jeweils

1. 2. 3. 4.

Uhrzeit

T.~EI.LF

3 2 12 14 13 6

13-15

1 0 7 10 0 0

13-15

8.5 87 31

7-9

L.

1554

RENSINCUND R. HARDELAND

geschhipft waren und in gleicher Individuenzahl unter sterilen Bedingungen aufwuchsen: schon die 2. Larvenhautung zieht sich in einer solchen Population iiber 24 Std. hin (RENSING unveriiff.)-berechnet man die Zahl der Vorpuppen zu den verschiedenen Tageszeiten in Prozent der Gesamtzahl von 3 Tagen (Abb. 3), so ergeben die Mittelwerte einen ahnlichen Kurvenverlauf wie in Abb. 2 a, b. Da ein solcher Tagesrhythmus der Pupariumbildung gelegentlich in anderen Untersuchungen nicht gefunden worden ist (BAKKER und NELISSEN, 1963), haben wir noch zwei andere Drosophila-Arten zum Vergleich herangezogen: einmal D. Victoria, bei der schon ein solcher Rhythmus beobachtet wurde (BERENDES pers. Mitt.), und zum anderen D. hydei. Das Ergebnis dieser Versuche, die wie alle folgenden von Kulturen ausging, in denen die Weibchen 2-3 Tage lang Eier abgelegt hatten, zeigt, dass D. victoria einen vie1 deutlicheren Rhythmus der Pupariumbildung aufweist (Tabelle 2) als D. melanogaster, wahrend sich bei D. hydei ein schwacher ausgepragter Rhythmus

6

9

12

15

18

21

24

3

9

6

12h

ABB. 4. Pupariumbildung bei D. victoriu (a) und D. hydei (b) im Kunsttag von 12 : 12 Std. LD bei einer Temperatur von 18,S”C. Ordinate: Prozentzahl der in jeweils 2 Std. gebildeten Puparien bezogen auf die Summe des Tages ; Abszisse : Tageszeit;

teilweise

doppelt

aufgetragen.

((a) n

334;

(b) n = 525.)

ZUR WIRKUNG

DER CIRCADIANEN

RHYTHMIK

VON DROSOPHILA

155.5

erkennen lasst (Tabelle 3). Auch ein Vergleich der Mittelwerte von mehreren Tagen (Abb. 4 a, b, 2 a) unterstreicht bei den drei Drosophila-Arten noch einmal in der Dunkelzeit die deutliche Rhythmik bei D. victoria, die ein Maximum aufweist und in der Hellzeit fast keine Puparien bildet, wahrend D. hydei und D. melanogaster jeweils in der Hellzeit ihr Maximum erreichen. Aus den bisherigen Versuchen geht zwar hervor, dass die Rhythmik vom LichtDunkel-Wechsel gesteuert wird, doch konnte das such ohne die Beteiligung eines

1 40 20 0 80 60 40 20 0 .3 40 * 20 *

mm 16 ABEL

20

24

4

8

12

h

5. Pupariumbildung bei D. victoria im LL von 7 lx nach vorherigem 12 : 12 Std. LD bei einer Temperatur von 18,S”C. Ordinate: Anzahl der in jeweils 2 Std. A Lage des Medians. Oberer gebildeten Vorpuppen; Abszisse: Tageszeit. Balken : letzter Hell-Dunkel-Wechsel.

L. RENSINC

1556

UND

R. HARDELAND

endogenen Rhythmus geschehen, etwa durch die Hemmung irgendeines Teilprozesses durch Licht oder Dunkelheit. Wir brachten daher zur Klarung dieser Fragestellung eine Kultur von D. victoria zu Beginn der Pupariumbildung aus einem 12 : 12 Std.-Tag in Dauerlicht von 7 lx. Das Ergebnis dieses Versuches (Abb. 5) lasst erkennen, dass der Rhythmus sich noch mindestens 3 Tage in konstanten Bedingungen halt. Berechnet man den Median der 3 aufeinanderfolgenden Gipfel, so ergibt sich ferner, dass die Periodenlange dieses Rhythmus urn a

b

0

3

6

g

12

15

10

21

24

3

6

h

ABB. 6. Pupariumbildung bei verschiedenen Temperaturen und einem 12 : 12 Std.-Tag. (a) 25°C (n = 1781), (b) 20°C (n = 678), (c) 15°C (n = 2840). Ordinate wie in Abb. 2 ; Abszisse : Tageszeit ; teilweise doppelt aufgetragen.

ZUR WIRKUNG

DER CIRCADIANEN

RHYTHMIK

VON DROSOPHILA

1557

70 min bzw. 63 min gegeniiber einer genau 24stiindigen Periode verlangert ist. Nachdem wir auf diese Weise wahrscheinlich machen konnten, dass bei der Pupariumbildung ebenso wie bei der Schliipfrhythmik ein endogener Rhythmus beteiligt ist, versuchten wir durch Variieren von verschiedenen Bedingungen wie Temperatur, Licht-Dunkel-VerhPltnis, Alter der Kultur und durch Zugabe von Pharmaka in das Medium etwas iiber die Eigenschaften des rhythmischen Systems zu erfahren. Die Phasenlage des Rhythmus in bezug auf den Zeitgeber Licht andert sich bei Temperaturen von 20-25°C offenbar nicht (Abb. 6a, b): das RsIaximum liegt in beiden Fallen am Ende der Lichtzeit; such die Unterschiede zwischen Maximum und Minimum liegen in der gleichen Grassenordnung. Bei 15°C ist das Maximum bis etwa in die Mitte der Dunkelzeit verschoben (Abb. 6c) a

6

9

12

15

18

21

24

3

6

h

7. Pupariumbildung bei unterschiedlichen Licht-Dunkel-Verh?ltnissen und einer Temperatur von 25°C. (a) 4 : 20 Std. (n = 221), (b) 12 : 12 Std. (n = 1277), (c) 20 : 4 Std. (n = 619). Ordinate wie in Abb. 2; Abszisse: Tageszeit; teilweise doppelt aufgetragen.

fbB.

L. RENSING UND R. HARDELAND

1558

und der Unterschied zwischen Maximum und Minimum relativ gering geworden. In dem letzten Versuch wurde allerdings ein Stamm von D. melanogaster verwandt, der fiber viele Jahre im Labor gehalten worden war und dessen Reaktionen nicht ohne weiteres mit denen des anderen Stammes vergleichbar sind. Veranderungen des VerhZltnisses von Licht- zu Dunkelzeiten haben eine deutliche Wirkung auf die Phasenlage des Rhythmus in bezug auf den Beginn von Licht- und Dunkelzeiten (Abb. 7a-c). In einem Tag von 4 Std. Licht und 20 Std. Dunkelheit liegt das Maximum mehrere Stunden nach Beginn der Dunkelheit, in einem 12 : 12 Std.-Tag bei dem Beginn und in einem Tag von 20 Std. Licht und 4 Std. Dunkelheit etwa 5 Std. vor Beginn der Dunkelheit. Ebenso wie bei den Versuchen mit der Rhythmik der Eiablage (Abb. 1) ist such hier die Verschiebung der Maxima gegeniiber der Mitte der Hell- bzw. Dunkelzeit geringfiigig. Vor allem bei dem Versuch mit langen Dunkelzeiten (Abb. 7a) muss man beriicksichtigen, dass wahrend der Dunkelzeit immer wieder stiirendes Licht wahrend der Zahlungen angeschaltet wurde. Die Phasenlage des Rhythmus hangt ausserdem von dem Alter der Kultur ab, wie Abb. 8 an einigen Beispielen zeigt. Vor allem der erste und letzte Tag der Vorpuppenbildung weichen von dem bisher dargestellten Verlauf ab-das erste Maximum wird spater, wahrend der Dunkelzeit, erreicht, das letzte friiher am Tage. Bei der Mittelwertbildung iiber viele Tage, die fur die vorangegangenen Kurven massgebend war, fielen diese Abweichungen nicht ins Gewicht.

o-36

9

12

15

18

21

ABB. 8. Lage des Maximums der Pupariumbildung Kulturen und 25°C. Ordinate: Alter der Kultur in baren Maximum der Pupariumbildung an; Abszisse: Symbole reprasentieren einzelne Kulturen; die eingezeichnet.

24

3

6

h

bei verschiedenem Alter der Tagen vom ersten registrierTageszeit. Die verschiedenen Kurve ist nach Augenmass

Bei einem Gehalt von 0,2% 2,4_Dinitrophenol im David-Medium ist die Entwicklungsdauer der Larven deutlich verlangert (vgl. THORNTON, 1947). Die Phasenlage und der Unterschied zwischen Maximal- und Minimalwerten dagegen sind nicht von denen der Normaltiere zu unterschieden (Abb. 9a). Deutlich verandert ist dagegen der Kurvenverlauf bei einem Medium, das O,l% Benzamid enthalt (Abb. 9b). Die Unterschiede zwischen Maximum und Minimum verringern sich auf etwa l/4 derjenigen der Kontrolltiere, wahrend die Phasenlage ungefahr

ZUR WIRKUNG

gleich bleibt. langert.

Auch

DER CIRCADIANEN

durch

dieses

RHYTHMIK

Pharmakum

wird

1559

VON DROSOPHILA

die Entwicklungsdauer

ver-

15

I

10

5

0

15

10

5

0

3

6

9

I 12

15

18 21

24

3

6

h

9. Pupariumbildung nach Zugabe van Pharmaka in das Medium bei 25°C. (a) 0,2% 2,4_Dinitrophenol (n = 956), (b) O,lyh Benzamid (n = 3329). Ordinate wie in Abb. 2; Abszisse: Tageszeit, teilweise doppelt aufgetragen. Die nicht gemessenen Nachtwerte in a wurden mit jeweils 10 Prozent veranschlagt. ABB.

Insgesamt verhalt sich die Pupariumbildung wie der Schhipfakt, wie ein l’organg also, der von einem lichtgesteuerten circadianen Rhythmus beeinflusst wird. Eine entsprechende Kurve ist such fur die Pupariumbildung von Coleopa f’rigida (Diptera) bekannt ( REMMERT, 1961), deren Maximum allerdings am Morgen hegt. Die geringen Differenzen zwischen der Anzahl der am Tage und der in der Nacht gebildeten Vorpuppen bei D. melanogaster haben wahrscheinlich BAKKER gefiihrt, dass kein Tagesrhythmus der und NELISSEN (1963) zu der Ansicht Pupariumbildung vorhanden sei. Die von dem Alter der Kultur abhangige Phasenverschiebung, die in vergleichbarer Form such bei dem Schliipfrhythmus von D. pseudoobscura auftritt

L.

1560

RFWSING

UND

R. HARDELAND

(PITTENDRIGH, 1954), kijnnte auf der Veranderung des Entwicklungszustandes der Gesamtpopulation beruhen : Die zuerst sich verpuppenden Larven haben eine

d G

1

6

9

12

75

18 21h

hB. 10. (a) Vertidenmg des Puffindex der Chromosomen-Region 74-78 (nach BECKER,1959) in einem 12 : 12 Std.-Tag bei 25°C. Jeder Punkt ist der Mittelwert von zehn Larven, die Symbole reprlsentieren verschiedene Versuchsserien. Ordinate : P&index; Abszisse : Tageszeit. (b) Die Chromosomen-Region 74-78 in den Puffstadien I, 4 und 8 (nach Fotografien). kiirzere Entwicklungszeit hinter sich als die sich zu einem spateren Zeitpunkt verpuppenden (vgl. S. 1553, Tabelle 1). Wenn man von der Moglichkeit ausgeht, dass das Ecdyson von Hautung zu Hautung summativ wirkt, so wiirde bei den Hlteren Larven eine geringere Erhiihung des Hormonspiegels geniigen, urn die Hautung in Gang zu setzen. Eine durch 2,4-Dinitrophenol oder Temperaturerhohung bewirkte Stoffwechselsteigerung verandert wenig an den hier gemessenen Parametern des Rhythmus der Pupariumbildung. Die starke Verringerung der Schwingungsweite des Rhythmus durch Benzamid lasst einmal auf die Beteiligung des RNS-Stoffwechsels der Hormondriisen schliessen, der nach ABD EL WAHABund SIRLIN (1959) durch Benzamid gehemmt wird. Ausserdem ist bemerkenswert, dass nicht die Phase, sondern die Schwingungsweite dieses Populationsrhythmus (vgl. WEVER, 1965) beeinflusst wird.

Pu$%ildung Nachdem bekannt war, dass die Puparien bei D. melanogaster im Normaltag vorwiegend am Ende der Lichtzeit gebildet werden, liessen sich damit such alle unmittelbaren Vorbedingungen, wie z.B. die Ecdysonausschiittung, zu einer bestimmten Tageszeit erwarten (RENSING, 1967). Wie CLEVER (1961) gezeig that, sind entwicklungsspezifische Puffs gute Indikatoren fiir die Ecdysonausschiittung : bei Injektion erscheinen sie innerhalb von 30 min, in der Normalentwicklung nach tjberschreiten eines spezifischen Ecdysontiters. Bei Drosophila ist der Doppelpuff 74 EF/75 B mit der Ecdysonausschiittung vor der Vorpuppen- und Puppenhautung verbunden (BECKER, 1962), so dass er als Indikator fur eine mogliche tagesperiodische Hormonabgabe dienen kann.

ZUR WIKRUNG

DER CIRCADIANEN

RHYTHMIK

VON DROSOPHILA

1561

Die Mittelwerte der Puffindices (Abb. lob, BECKER, 1959) zeigen in den 4 V-ersuchsserien jeweils den hiichsten Wert zwischen 12-15 hr (Abb. 10a). In der Zeit kurz nach Lichtbeginn sind alle Werte iibereinstimmend niedrig. Diese Ergebnisse harmonisieren gut mit denen der Schniirungsversuche von BECKER (1962), die auf eine Ecdysonausschiittung 5 Std. vor der Hautung hinweisen: in unseren Versuchen betragt der Abstand zwischen der maximalen Puffausbildung und dem Maximum der Pupariumbildung etwa 4-5 Std. Sie unterstiitzen ferner die histologischen Befunde an den Prothoraxdriisen von L)rosophilalarven (RENSING, 1966b), die aufgrund der Schwankungen des Kernvolumens eine tagesperiodische Aktivitat vermuten liessen. Entwicklung

von der Vorpuppen-

zur Puppenhiiutung

Bei den Entwicklungsschritten, die in einem bestimmten zeitlichen Abstand vor oder nach der Vorpuppenhautung erfolgen, ergibt sich die Frage, ob die Kopplung eines solchen Schrittes an eine Tageszeit nur eine Folge des Rhythmus der Pupariumbildung ist oder ob der betreffende Schritt such unabhangig von der Pupariumbildung von einem endogenen Rhythmus oder dem Licht-Dunkel\Vechsel beeinflusst wird. Dazu untersuchten wir die Puppenhautung bzw.

D ib3B. 11. Dauer

9

12

L

15

1e

2lh

des Vorpuppenstadiums im 12 : 12 Std.-Tag bei l8,S”C. Ordinate Entwicklungsdauer in Std. ; Abszisse : Tageszeit der Pupariumbildung. Jeder Punkt reprgsentiert den Median einer Stichprobe von 20-30 Exemplaren.

:

1562

L. RENSING UND

R. HARDELAND

Kopfausstiilpung, die bei D. melanogaster (18,SC) etwa 18-20 Std. auf die Vorpuppenhlutung folgt. Wie Abb. 11 zeigt, erfolgt die Verpuppung zu verschiedenen Tageszeiten, je nachdem, zu welcher Tageszeit die Vorpuppenbildung stattgefunden hat. Das Entwicklungsintervall zwischen beiden Hautungen bleibt jedoch nicht konstant : Tiere, die sich morgens zur Vorpuppe gehautet haben, verpuppen sich nach ungefahr 18 Std., wahrend bei den Vorpuppen von 14-15 h die Entwicklungsdauer sprunghaft auf etwa 19-19,5 Std. ansteigt und bei den Vorpuppen von 21 h schliesslich eine Lange von 20 Std. erreicht. Die Unterschiede in der Entwicklungsdauer zwischen den Tieren, die urn 13 h und denen, die urn 14 h die Vorpuppenentwicklung begannen, sind mit einem P< 0,OOOl statistisch gut gesichert. Wodurch unterscheiden sich nun die am Vormittag von denen am Nachmittag gebildeten Vorpuppen ausser durch ihre Lage in bezug auf den Licht-DunkelWechsel? Wir versuchten zunachst experimentell, und zwar iiber das Puffmuster, Aufschluss iiber diese Unterschiede der beiden Gruppen zu erhalten. Abb. 12a

18

21

24

3

6

9

12

15

ldh

.bB. 12. Veranderungen der Puffgrosse der Chromosomen-Region 85 C-F wahrend des Vorpuppenstadiums bei 18,S”C in einem 12 : 12 Std.-Tag. (a) Morphologische Veranderungen (nach Fotografien), (b) Puffgrosse von Vorpuppen, die 1 Std. oder (c) 9 Std. vor dem Dunkelbeginn gebildet wurden. Ordinate: Puffgrossenquotient (s. S. 1549) ; Abszisse : Tageszeit. Gestrichelte Linie : Pupariumbildung bzw. Verpuppung; schwarze Blocke: Auftreten der Puffs 74 EF/75 B. Jeder Punkt ist der Mittelwert von 3-5 Messungen an einer Vorpuppe. Die kurven sind nach Augenmass lingezeichnet.

ZUR WIRKUNG DER CIRCADIANEN RHYTHMIK

VON

1563

DROSOPHILA

zeigt die Veranderungen im Puffmuster wahrend der Vorpuppenentwicklung in der Region 85 C-F. Vor allem an der unteren Region ist ein Zyklus des ‘puffing’ am deutlichsten zu erkennen, der aus Puffvergrosserungen in den Zwischenhiiutungszeiten und -riickbildungen zur Zeit der vermutlichen Ecdysonausschiittung besteht. Der Zyklus dieser Puffs bei den Tieren, die sich am Abend zu Vorpuppen sich kaum von dem bei vormittags gehautet haben (Abb. 12b), unterscheidet gebildeten Vorpuppen (Abb. 12~). Nur was die Dauer des Entwicklungsintervalls angeht, wird das Ergebnis des vorangegangenen Versuchs noch einmal bestatigt;

I%,,

a

20 10 0 b

20 10 o

c 20 10 0 20 10 0 20

: l

IO 0

8

12

16

20

24

4

8

12

h

ABB. 13. Verlauf des Schliipfens im LL von 30 lx von der Pupariumbildung an (vorher 12 : 12 Std. LD). Pupariumbildung : (a) IS h, (b) 18 h, (c) 21 h, (d) 24 h, (e) 3 h. Ordinate: Prozentzahl der in 2 Std. geschltipften Tiere bezogen auf die gesamte Probe; Abszisse: Tageszeit. Der linke Gipfel reprasentiert die Weibchen, der rechte die MPnnchen.

1564

L. REINSING UND R. HARDELAND

ob die Kurve in Abb. 12c etwas flacher verlauft als in Abb. 12b, ist aufgrund dieser Daten nicht zu sichern. Die schon S.1560 angedeutete Mijglichkeit eines Unterschieds im Ecdysontiter zwischen Vorpuppen von verschiedenen Tageszeiten bleibt such nach diesen Versuchen hypothetisch, obschon der Puff 8.5 C-F wahrscheinlich auf dieses Hormon reagiert-die Entwicklungsdauer ist mijglicherweise von der jeweiligen Lage der Vorpuppenhautung zu den beiden tageszeitlich auftretenden Maxima und Minima des O,-Verbrauches (RENSING, 1966a) abhangig. Das ware dann der Fall, wenn zur Vollendung eines bestimmten Entwicklungsintervalls ein relativ konstanter Stoffumsatz erforderlich ist, der sich such in einer entsprechenden Menge verbrauchten Sauerstoffs manifestiert. Je nach Lage des Beginns dieses Entwicklungssintervalls-vor oder nach einem Maximum des O,-Verbrauchs-wiirde diese Menge in unterschiedlichen Zeiten erreicht werden. Auf jeden Fall liegt hier offenbar keine strenge Kopplung der Verpuppung an eine bestimmte Tageszeit bzw. eine bestimmte Phase des endogenen Rhythmus vor. Entwicklung von der Vorpuppenbildung bis zum Schliipfen Im Gegensatz zuden Ergebnissen des letzten Versuchs ist eine solche Kopplung an eine Phase des endogenen Rhythmus offenbar beim Schliipfen vorhanden (PITTENDRIGH, 1954,1966; ENGELMANN,1966),wobei ein Ubergangvon Dauerlicht zu Dauerdunkel geniigt, urn eine synchronisierte Rhythmik in der Population zu erzeugen. Wir untersuchten Puppen in Dauerlicht von 30lx,diebis zurVorpuppenbildung in einem 12 : 12 Std.-Tag gehalten wurden. Abb. 13 zeigt, dass unter diesen Bedingungen keine Wirkung eines endogenen Rhythmus mehr zu erkennen ist. Die Mediane der Schliipfkurven fiir Weibchen (linker Gipfel) und MHnnchen (rechter Gipfel) liegen alle ungefahr im selben zeitlichen Abstand zueinander wie vorher bei der Vorpuppenbildung der einzelnen Versuchsgruppen. Dieses Ergebnis spricht dafiir, dass in Dauerlicht der Rhythmus tatsachlich erlischt (PITTENDRIGH, 1966) und dass nicht nur die Rhythmen der Einzelindividuen desynchronisieren. Hier tritt ausschliesslich die ontogenetische Entwicklungszeit in Erscheinung. DISKUSSION Bisher sind fast nur bei Insekten Entwicklungsschritte nachgewiesen, die von einem circadianen Rhythmus gesteuert oder zumindest beeinflusst werden. Darunter nimmt der Schliipfrhythmus eine besondere Stellung ein, sowohl wegen seiner allgemeinen Verbreitung innerhalb der verschiedenen Insektenordnungen (REMMERT, 1962), als such wegen der vielmltigen Untersuchungen i.iber den ihm zugrunde liegenden circadianen Rhythmus (PITTENDRIGH, 1954, 1966). Sehr wenig ist im Vergleich dazu iiber das Vorkommen von Schliipfrhythmen vom Ei zur Larve, von Hautungs- oder Verpuppungsrhythmen bekannt (vgl. RENSING, 1965b)-ein anderer Ansatzpunkt zum Nachweis einer Wirkung der Tagesperiodik auf die Entwicklung ist die Entwicklungsdauer, die in Abhangigkeit von dem tageszeitlichen Beginn eines bestimmten Entwicklungsintervalls periodischen

ZUR WIRKUNGDER CIRCADIANEN RHYTHMIKVON DROSOPHILA

1565

Anderungen unterworfen ist (HARKER, 1965). Auch hierbei dienen aumllige Entwicklungsschritte, wie das Auftreten der Augenoder Fhigelpigmente zur hlarkierung der Entwicklungsdauer. Bei Untersuchungen iiber die Schliipfrhythmik von Drosophila l&t sich immer wieder feststellen, dass der Schliipfakt offenbar mit einer bestimmten Phase des clrcadianen Rhythmus gekoppelt ist : nach einmaligem ijbergang von Dauerlicht zu Dauerdunkel schliipfen die Fliegen einer Drosophilapopulation jeweils in begrenzten Zonen mit einem Abstand von etwa 24 Std. (PITTENDRIGH, 1966). Diese Art von Kopplung, die wie ein Reiter auf einer Schaltuhr ein in der Entwicklung gerade mijgliches Ereignis auslijst, gilt anscheinend nicht fiir die hier untersuchten Entwicklungsschritte in gleicher Weise. Zumindest bei D. melanogaster treten Vorpuppenhgutungen iiber den gesamten ‘I’ag verteilt auf; dasselbe trifft wahrscheinlich such fiir bestimmte Puffs und die Puppentigutung zu. Ebenso sind bei der Augen- und Fliigelpigmentbildung in den Versuchen HARKER’S (1965) nur wenige Std. des Tages auszumachen, zu denen diese betreffenden Ereignisse nicht auftreten. Diese Zonen lassen sich jedoch wahrscheinlich dadurch erklgren, dass die Vorpuppen nur in einstiindigen AbSt&den abgesammelt worden sind, wodurch sich eventuelle Zwischenwerte nicht erkennen lassen. Die Art des Einflusses der circadianen Rhythmik auf diese Entwicklungsschritte muss also indirekter und lockerer sein als auf das Schliipfen. Urn eine Ubersicht iiber die vielfiltigen Beziehungsmijglichkeiten zwischen der circadianen Periodik, dem Licht-Dunkel-Wechsel und dem ontogenetischen Entwicklungsprozess auf der einen und einem bestimmten Entwicklungsschritt auf der anderen Seite zu gewinnen, sei hier folgendes Diagramm diskutiert (Abb. 14):

y;q,

,lii”,pj,

&B. 14. Die miiglichen Wirkungen des circadianen Bhythmus und des LichtDunkel-Wechsels (LD) auf die zeitlische Bestimmung eines Entwicklungsschrittes. EP: Entwicklungsprogramm; CR: circadianer Rhythmus; ES: Entwicklungsschritt. (a) ‘Strenge Phasenkopplung’, (b) ‘schwache Phasenkopplung’, (c) exogene Beeinflussung durch den Licht-Dunkel-Wechsel. (Nghere Erkliirung s. Text.)

(1) Ein bestimmter Entwicklungsschritt, wie z.B. das Schliipfen, kann dann erfolgen, wenn sowohl vom Entwicklungsprogramm, wie such von der endogenen 100

1566

L. RENSINGUND

R. HARDELAND

Periodik her die Voraussetzungen dafiir gegeben sind (Abb. 14a). Die Voraussetzungen von seiten der endogenen Periodik sind nur wahrend einer bestimmten, begrenzten Phase des Rhythmus vorhanden (strenge Phasenkopplung). Nur innerhalb dieser ‘Zone’ kiinnen sich Unterschiede im Alter der Kultur, d.h. im auswirken (PITTENDRIGH, 1954). Eine Verbindung Entwicklungsprogramm, zwischen der Periodik und dem Entwicklungsprogramm ist fiir diese Art der Steuerung nicht notwendig. (2) Ein Entwicklungsschritt wie die Vorpuppenbildung oder Verpuppung bei D. melanogaster und D. hydei ist nicht fest an eine Phase des circadianen Rhythmus gebunden. Der Rhythmus beeinflusst dagegen das Entwicklungsprogramm im Sinne einer periodischen Beschleunigung oder Verzogerung (‘schwache Phasenkoppiung’; Abb. 14b). Aus dieser Wirkung heraus erfolgt dann die zeitliche Bestimmung des Entwicklungsschrittes nach einem noch unbekannten Mechanismus. Im Zusammenhang mit unserer Kenntnis der Tagesrhythmik der Hormone (RENSING, 1965d, 1966b) kiinnte man vermuten, dass ein hormone11 bedingter Entwicklungsschritt durch einen bestimmten Hormontiter summativ erreicht eine strenge Phasenkopplung durch eine nervijs wird (vgl. S. 1560), wahrend gesteuerte Verhaltensweise bedingt ist. (3) Es ware weiterhin moglich, z.B. bei der Vorpuppenbildung von D. melanogaster und D. hydei, dass durch eine rein exogene Wirkung des Licht-DunkelWechsels auf das Entwicklungsprogramm, ebenfalls im Sinne einer periodischen Beschleunigung oder Verzogerung, eine Rhythmik induziert wird (Abb. 14~). In den drei besprochenen Model&hen haben wir einmal die verschiedenen Wirkungen des endogenen Rhythmus, zum anderen den exogenen Einfluss eines Licht-Dunkel-Wechsels auf die zeitliche Bestimmung eines Entwicklungsschrittes skizziert. Ausser den aufgefiihrten Beziehungen gibt es noch andere Verbindungen zwischen den dargestellten Elementen. So kann such das Entwicklungsprogramm den Tagesrhythmus beeinflussen (vgl. RENSING, 1965a). Desgleichen ist eine Kombination der 3 Modellfalle moglich, etwa bei der Vorpuppenbildung von D. Victoria, bei der zwar wahrend bestimmter Tageszeiten keine Vorpuppen gebildet werden, die Streuung jedoch grosser ist als bei der Schliipfrhythmik (Kombination 14a, b). Genauso ware ein gleichzeitiges Vorhandensein der Mijglichkeiten 14a und 14c denkbar, doch wiirde wohl die exogene Komponente gegeniiber der strengen Phasenkopplung nicht zum Tragen kommen und sich somit einer experimentellen Analyse weitgehend entziehen. Eine Kombination von 14b und 14c, die sich in einer Summation der Effekte beider Mechanismen manifestieren wiirde, kijnnte bei der Vorpuppenbildung von D. melanogaster und D. hydei verwirklicht sein, wurde aber experimentell nicht weiter verfolgt. Bisher haben wir anhand dieser Schemata die zeitliche Bestimmung eines Entwicklungsschrittes diskutiert. Betrachtet man nun die Entwicklungsdauer unter Die Ergebnisse iiber die Dauer des diesen Aspekten, so ergibt sich folgendes: vom tageszeitlichen Eintritt in dieses Vorpuppenstadiums in Abhangigkeit

ZUR WIRKUNG

DER CIRCADIANEN

Stadium sowie die Untersuchungen lassen die Msglichkeit 14c als nicht

RHYTHMIK

VON

1567

DROSOPHILA

HARKER’S (1965) in konstanten realisiert erscheinen.

Bedingungen

ZUSAMMENFASSUNG (1) Die Eiablage erfolgt tagesperiodisch. Ein Hauptmaximum liegt in einem 1.2 : 12 Std.-Tag kurz nach Beginn der Dunkelheit, ein wesentlich kleineres zur blittagszeit. (2) Die Zahl derneugebildeten Vorpuppen in einer Population erreicht in einem 1.2 : 12 Std.-Tag ein Maximum am Abend, ein Minimum am Morgen. Durch Verschiebung des kiinstlichen Licht-Dunkel-Wechsels gegeniiber dem natiirlichen Tag lhst sich die Rhythmik der Pupariumbildung verschieben. Auch nach einer einmaligen Eiablage iiber 12 Std. bleibt diese Rhythmik nachweisbar. (3) D. Victoria zeigt einen ausgeprsgteren, D. hydei einen schwgcheren Rhythmus der Pupariumbildung als D. melunogaster. In Dauerlicht von 7 lx bleibt der unter diesen Bedingungen untersuchte Rhythmus von D. victoria mindestens 3 Tage bestehen. (4) Anderungen der Temperatur, des Verhzltnisses von Licht- zu Dunkelzeit und des Alters der Kultur, sowie die Zugabe von Pharmaka wurden in ihren Auswirkungen auf die Rhythmik der Pupariumbildung untersucht. 0,19;, Benzamid reduziert den Unterschied von Maximalund Minimalwerten auf l/4 keine Anderung desjenigen der Kontrollen, wghrend 0,2 “//o 2,4_Dinitrophenol bewirkt. (5) Die Mittelwerte der Puffindices des Chromosomenbereichs 74-78 erreichen ihren hiichsten Wert 3-6 Std. nach Lichtbeginn in einem 12 : 12 Std.-Tag. (6) Bei am Morgen gebildeten Vorpuppen dauert das Vorpuppenstadium ( liS,S°C) etwa 1S Std., wshrend am Nachmittag gebildete Vorpuppen sich nach 19-20 Std. verpuppen. Das Puffmuster der Region 85 C-F unterscheidet sich nicht u.esentlich in beiden Versuchsgruppen. (7) Das Entwicklungsintervall von der Vorpuppenbildung bis zum Schliipfen ist in Dauerlicht von 30 lx unabhingig vom tageszeitlichen Beginn der Entwicklung. LITERATUR ABD

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1568

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